近年來，造成人類感染的病原微生物日益復(fù)雜，種類增多，抗菌藥物濫用致使細(xì)菌耐藥，病原微生物已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。感染是急危重癥患者死亡的主要原因之一，隨著新發(fā)病原微生物的出現(xiàn)、耐藥病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的發(fā)病率和死亡率居高不下。
據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，在全球，感染性疾病導(dǎo)致患者死亡占全部死因的25%以上，每年1300萬兒童死于感染性疾病。在中國，感染性疾病占所有疾病的50%以上，造血系統(tǒng)腫瘤患者75%死于感染，實(shí)體腫瘤患者50%死于感染，膿毒癥（嚴(yán)重感染）患者病死率高達(dá)50%。重癥感染起病急、進(jìn)展快、病原體復(fù)雜，短時(shí)間內(nèi)能否明確致病病原微生物至關(guān)重要。
面對重癥感染患者，能否快速確認(rèn)感染病原體，成為后續(xù)對癥治療的關(guān)鍵，基于宏基因組新一代測序技術(shù)（metagenomics next-generation sequencing, mNGS）為解決這一問題提供了一個(gè)可能的突破方向。
傳統(tǒng)的微生物鑒定方法分為培養(yǎng)和非培養(yǎng)兩類，臨床公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是分離培養(yǎng)和生化鑒定，這種方法的操作周期長、失敗率高，并且不是每種病原體都可以培養(yǎng)。不依賴培養(yǎng)的方法比如涂片鏡檢、抗體抗原免疫等，在采樣當(dāng)天即可報(bào)告結(jié)果。
這些方法的時(shí)效性強(qiáng)，但在敏感性和特異性上存在較明顯的劣勢，而且傳統(tǒng)的微生物鑒定方法對于未知或者罕見的病原微生物，無法快速識(shí)別。mNGS不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，也無需特異性擴(kuò)增，直接對臨床樣本中的核酸進(jìn)行無差別、無選擇性的高通量測序，然后與已知的微生物序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，根據(jù)比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀地檢測臨床樣本中的病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲）。
在急危重癥感染中，患者往往因?yàn)檫z傳性疾病、腫瘤、營養(yǎng)不良、器官移植、藥物等因素導(dǎo)致免疫缺陷，除了遭受普通感染外，尤其容易受到機(jī)會(huì)性感染，即條件致病菌引起的感染。這類感染涉及的微生物種類復(fù)雜，很難根據(jù)經(jīng)驗(yàn)提前預(yù)判，常規(guī)檢測方法無法覆蓋。
相比之下，mNGS理論上可以報(bào)告所有已知基因組序列的病原體，目前已經(jīng)納入的病原體有8000多種，其中包括3000余種細(xì)菌、4000余種病毒、200余種真菌和140種寄生蟲，除了病原體覆蓋廣、準(zhǔn)確性高，mNGS還可以獲取耐藥突變信息和毒力基因，高覆蓋度的mNGS還可以評估病原體的藥物敏感性，精準(zhǔn)指導(dǎo)臨床用藥。
憑借上述優(yōu)點(diǎn)，mNGS逐漸開始被一些臨床醫(yī)生認(rèn)可和嘗試使用，相關(guān)的臨床指南和專家共識(shí)也對mNGS有所提及，2017年，《中國利士曼原蟲感染診斷和治療專家共識(shí)》提到：“有文獻(xiàn)報(bào)告用二代測序等方法成功診斷骨髓穿刺與活組織檢查未能發(fā)現(xiàn)的病例，將來有可能應(yīng)用于臨床?！?。
2018年，《兒童呼吸道感染微生物檢驗(yàn)標(biāo)本采集 轉(zhuǎn)運(yùn)與檢測建議（細(xì)菌篇）》指出：“高通量的宏基因組測序是對感染性疾病病原體的大規(guī)模核酸分析，可提供極為豐富的信息，對于未知病原體的發(fā)現(xiàn)具有不可比擬的優(yōu)勢，是分子生物學(xué)診斷的研究熱點(diǎn)?！?/span>
《兒童呼吸道感染微生物檢驗(yàn)標(biāo)本采集 轉(zhuǎn)運(yùn)與檢測建議（病毒篇）》提到：“二代測序技術(shù)不但在高通量方面表現(xiàn)出優(yōu)勢，而且在發(fā)現(xiàn)新病原方面也有突破性進(jìn)展，但目前二代測序的結(jié)果還需要驗(yàn)證，不能直接用于臨床診斷，且費(fèi)用較高，要廣泛應(yīng)用尚待時(shí)日?！?/span>
《終末期肝病合并感染診治專家共識(shí)》提到：“二代測序方法從組織、拭子、抽吸物中提取DNA進(jìn)行分析，可篩查鑒別多種細(xì)菌，快速獲取病原學(xué)診斷?！?/span>
《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)肺炎診斷和治療指南（2018版）》指出：“基于測序技術(shù)的臨床宏基因組學(xué)可用于快速鑒定細(xì)菌、真菌、分枝桿菌、病毒等病原微生物及其耐藥性，但技術(shù)成本高，僅限在有條件的單位開展。”2019年，《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識(shí)》發(fā)布。
由已有發(fā)布的臨床指南和專家共識(shí)可以看出，雖然在指南和專家共識(shí)中開始對mNGS有所提及和推薦，但幾乎所有的指南和專家共識(shí)仍然對其持比較謹(jǐn)慎的態(tài)度，對其目前結(jié)果的驗(yàn)證、檢測的成本和開展的條件等方面都給出了尚不成熟的提示。
mNGS作為二代測序成本快速降低而興起的一門全新領(lǐng)域，若用于體外診斷試劑的研發(fā)，有其優(yōu)勢，但也存在很多技術(shù)和法規(guī)監(jiān)管中的難點(diǎn)，本文初步總結(jié)如下。
mNGS需要對不同類型的臨床樣本進(jìn)行預(yù)處理，操作步驟包括但不限于：核酸提取、文庫制備、純化、定量、上機(jī)前質(zhì)控等。再加上測序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析，整體流程復(fù)雜、耗時(shí)長，自動(dòng)化程度低。大多數(shù)文庫制備方法包含PCR擴(kuò)增步驟，有可能產(chǎn)生氣溶膠污染，在實(shí)際臨床取樣、運(yùn)輸、樣本處理、上機(jī)測序等環(huán)節(jié)中都有可能受到環(huán)境、容器、試劑中的微生物核酸污染。因此實(shí)驗(yàn)室在防止污染和質(zhì)量控制上需要建立一系列標(biāo)準(zhǔn)化SOP。
mNGS可以覆蓋8000種以上病原體，檢測靈敏度很高。但這是把雙刃劍，一方面有可能受到環(huán)境、容器、試劑中的微生物核酸污染；另一方面，人體含有定植性的微生物（不同個(gè)體、不同樣本類型，定植微生物的種類和豐度有較大差異）。這些因素都會(huì)導(dǎo)致mNGS結(jié)果中含有大量非致病性微生物，而真實(shí)的病原體則隱藏在定植和背景微生物中。因此，如何結(jié)合樣本類型、實(shí)驗(yàn)對照和臨床信息來準(zhǔn)確判斷病原體，是必須攻克的難題。對于mNGS的檢測報(bào)告，檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)盡可能提供檢測列表，而不是做出判斷，由臨床醫(yī)生結(jié)合檢測結(jié)果和臨床病史做出判斷。
對于胞內(nèi)感染菌因釋放到體液中含量較少而導(dǎo)致檢測敏感性偏低，對具有較厚細(xì)胞壁的病原微生物如真菌感染，由于核酸提取效率較低，導(dǎo)致臨床檢出率和敏感性較低。因此即使在檢測報(bào)告中某種胞內(nèi)菌/厚壁菌檢出序列數(shù)不高，也要考慮其為致病病原體的可能。mNGS信息量大，不可能在報(bào)告中列舉出所有檢測到的病原體，對于罕見病原體、胞內(nèi)菌等，可能因檢出序列數(shù)少、微生物豐度低，在報(bào)告中未能列舉，如果臨床有疑似特殊病原體的感染，應(yīng)該可以追溯原始數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢。?
一些病毒的基因組為RNA，用DNA建庫的方法不能檢出。同時(shí)，RNA豐度與基因轉(zhuǎn)錄活躍程度正相關(guān)，檢測RNA可以識(shí)別死菌和活菌，區(qū)分現(xiàn)行和既往感染。因此，DNA+RNA測序與DNA測序相比具有多重優(yōu)勢，但人源RNA比DNA有更高的豐度和復(fù)雜度，且RNA易降解，對樣本運(yùn)輸和保存有更高的要求。如何穩(wěn)定有效地實(shí)現(xiàn)DNA和RNA同時(shí)檢測，是提升mNGS臨床檢出率和準(zhǔn)確性的保障之一。
人體不同的樣本類型單位體積含有的細(xì)胞數(shù)量有巨大的差異，最終的測序數(shù)據(jù)由微生物序列和人源基因組序列組成，不同數(shù)量的人體細(xì)胞數(shù)、病原微生物感染的類型和感染量的高低都會(huì)影響測序數(shù)據(jù)中目標(biāo)微生物序列占比，大量的人體背景細(xì)胞（如全血樣本）以及很多病原體感染后含量很低，包括用藥后取樣導(dǎo)致的病原數(shù)量降低，都會(huì)導(dǎo)致限定數(shù)據(jù)量中靶病原信息太少而丟失。單純擴(kuò)?數(shù)據(jù)量，提高檢測深度是最簡單的辦法，但同時(shí)會(huì)帶來檢測成本的大幅度上升，如何平衡臨床靈敏度的需求和檢測成本的迅速增加，可能是mNGS面臨的最大挑戰(zhàn)。
目前使用mNGS進(jìn)行藥敏檢測還存在一定的困難，一是目前報(bào)道的耐藥基因型與耐藥表型的關(guān)聯(lián)程度還存在一些差距；二是如果要應(yīng)用mNGS對臨床樣本進(jìn)行耐藥相關(guān)基因的分析，那將需要極高的測序深度，成本將數(shù)千倍地上升，因此，當(dāng)前的mNGS尚不能完全指導(dǎo)耐藥菌抗感染藥物的選擇。
目前微生物檢驗(yàn)室對于微生物的鑒定有一套成熟的檢驗(yàn)流程，mNGS作為一種全新的檢測手段，如何在當(dāng)前微生物檢驗(yàn)流程中找到適合的切入點(diǎn)，如何科學(xué)地設(shè)計(jì)產(chǎn)品、合理地選擇預(yù)期人群并在在正確的時(shí)機(jī)開展檢測，找到適合的應(yīng)用場景是mNGS作為一種實(shí)驗(yàn)室新興技術(shù)向產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。
mNGS作為一項(xiàng)優(yōu)勢明顯的技術(shù)，向產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變是必然的趨勢，在醫(yī)療器械監(jiān)管的過程中，尤其是體外診斷試劑審評過程中，以下一些方面應(yīng)該重點(diǎn)考慮。
1、規(guī)范臨床適應(yīng)人群及臨床適應(yīng)癥。根據(jù)目前的臨床經(jīng)驗(yàn)、研究結(jié)果和mNGS技術(shù)的優(yōu)勢，mNGS的臨床適應(yīng)人群應(yīng)以急危重癥感染患者為主，其主要適應(yīng)癥包括：
②特殊病人如免疫抑制宿主、合并基礎(chǔ)疾病、反復(fù)住院的重癥感染患者需要盡快明確病原體；
③傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)反復(fù)陰性且治療效果不佳；
④疑似新發(fā)病原體、臨床上提示可能有一定的傳染性；
⑥長期發(fā)熱和/或伴有其他臨床癥狀、病因不明的感染。
2、應(yīng)結(jié)合患者負(fù)擔(dān)和收益比，重點(diǎn)對產(chǎn)品的臨床意義進(jìn)行審評。
3、mNGS可以早期發(fā)現(xiàn)病原體，指導(dǎo)抗菌藥物的精準(zhǔn)選擇，減少抗菌藥物的使用，降低患者的病死率，但尚需要大樣本的研究證實(shí)，因此，mNGS的產(chǎn)品在臨床試驗(yàn)階段應(yīng)根據(jù)其產(chǎn)品設(shè)計(jì)，選擇預(yù)期用途的適用人群進(jìn)行足夠樣本量的驗(yàn)證。同時(shí)，由于mNGS產(chǎn)品臨床可能的適應(yīng)人群的特殊性和罕見性，在入組足夠數(shù)量的人群時(shí)可能會(huì)存在較大的困難，這一點(diǎn)可能將是以后臨床審評中的難點(diǎn)。
4、對于嚴(yán)重感染、生命體征不穩(wěn)定的患者，由mNGS獲得致病病原體后，針對病原體進(jìn)行精準(zhǔn)治療，治療后應(yīng)密切隨訪患者的臨床表現(xiàn)和治療效果，因此應(yīng)有部分的隨訪數(shù)據(jù)。
5、病原特征數(shù)據(jù)庫與算法要有系統(tǒng)研發(fā)，在審評中對算法的審評應(yīng)結(jié)合數(shù)據(jù)庫一起作為審評的重點(diǎn)環(huán)節(jié)，不能簡單認(rèn)為把公共數(shù)據(jù)庫中的微生物納入越多越好。
目前由于該類產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化仍存在一定的難度，尚無體外診斷類產(chǎn)品申報(bào)和獲批。
文章來源：CMDE 中國器審，臨床與生物統(tǒng)計(jì)二部?胡鵬 供稿
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