受理號：CSZ2200011
體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術(shù)審評報告
產(chǎn)品中文名稱：α 和 β 地中海貧血基因檢測試劑盒 （聯(lián)合探針錨定聚合測序法）?
產(chǎn)品管理類別：第三類?
申請人名 稱：華大生物科技（武漢）有限公司?
國家藥品監(jiān)督管理局?
醫(yī)療器械技術(shù)審評中心
基本信息
二、申請人住所 武漢市東湖新技術(shù)開發(fā)區(qū)高新大道 666 號武漢國家生物 產(chǎn)業(yè)基地項目 B、C、D 區(qū)研發(fā)樓 B2 棟?
三、生產(chǎn)地址 武漢市東湖新技術(shù)開發(fā)區(qū)高新大道 666 號武漢國家生物產(chǎn) 業(yè)基地項目 B、C、D 區(qū)研發(fā)樓 B2 棟五樓、B1 棟一樓
技術(shù)審評概述
一、產(chǎn)品概述?
表 1 主要組成成分
（二）產(chǎn)品預(yù)期用途?
本試劑盒用于文庫構(gòu)建，采用高通量測序技術(shù)（聯(lián)合探 針錨定聚合測序法）定性檢測人外周血樣本中基因組 DNA的 4 種 α-地貧缺失型、2 種 β-地貧缺失型、3 種 α-地貧非缺失 型和 16 種 β-地貧非缺失型。用于 α 和/或 β 地貧的輔助診斷（遺傳診斷）。本試劑盒檢測結(jié)果不作為地中海貧血臨床診 斷的唯一依據(jù)，僅供臨床參考。?
表 2 試劑盒檢測的地中海貧血基因變異信息
（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格?
（四）產(chǎn)品檢驗原理?
根據(jù) α-地貧和 β-地貧發(fā)生相關(guān)的 HBA1、HBA2 和 HBB 三個基因的特點設(shè)計一系列引物，以實現(xiàn)基因的有效擴增。利用多重 PCR 技術(shù)將樣本中的 HBA1、HBA2 和 HBB 基因 擴增富集并同時引入用于樣本識別的標簽序列。將多例（≤96 例）樣本的 PCR 產(chǎn)物按一定比例混合成一個文庫，經(jīng)過 一系列的文庫制備過程，每個文庫中的樣本 DNA 序列都加 上了用于測序及文庫識別的接頭序列。將制備好的文庫等質(zhì) 量比例上機測序，使用基因測序儀通過聯(lián)合探針錨定聚合測 序技術(shù)對各文庫中的樣本 DNA 進行序列信息讀取。每一條 DNA 的測序結(jié)果經(jīng)過文庫接頭序列、樣本標簽序列和引物序 列比對拆分后將被精確定位到每一個樣本的每一個擴增區(qū) 域中。
將每個樣本的目標區(qū)域的測序結(jié)果與以 GRCh37 基因 組序列為參考構(gòu)建的目標參考序列進行比對分析，再通過變 異檢測、陽性判斷值以及來自于 HbVar（2017 年 10 月版） 和 Ithanet 數(shù)據(jù)庫（2017 年 10 月版）的變異坐標信息與變異 名稱信息，判斷樣本中是否存在地貧基因變異以及何種變異。
?二、臨床前研究概述?
試劑盒主要原材料包括：PCR 標簽引物、PCR 反應(yīng)液、 PCR 反應(yīng)熱啟動酶、測序接頭、末端修復(fù)緩沖液、T4 多聚 核苷酸磷酸激酶、T4 DNA 聚合酶 （rTaq 聚合酶）、Klenow Fragment、加“A”酶、連接酶、磁珠、陽性對照品、陰性對照 品等。主要原材料均為外購方式獲得。PCR 標簽引物和測序 接頭為申請人自行設(shè)計后由專業(yè)的合成公司合成。
申請人選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供原料，通過功能性試驗篩選出最佳原 材料和供應(yīng)商，制定了各主要原材料質(zhì)量標準并經(jīng)檢驗合格。?
2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況
企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、重復(fù)性參考 品、精密度參考品、檢測限參考品。陽性參考品 37 份，由外 周血樣本和細胞系樣本組成，樣本涵蓋該產(chǎn)品可檢出的所有 變異類型的雜合型；陰性參考品 14 份，由外周血樣本和細胞 系樣本組成，包含無變異樣本、產(chǎn)品檢測范圍外的地貧變異 類型樣本及同源序列變異樣本；重復(fù)性參考品 5 份，均為細 胞系樣本，涵蓋產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類型和 1 份無 變異的陰性樣本；精密度參考品 5 份，為包含弱陽性濃度水 平在內(nèi)不同濃度水平和無變異的外周血樣本；檢測限參考品 4 份，均為細胞系樣本，每份檢測限參考品做高、中、低 3 個 水平的梯度稀釋，涵蓋該產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類型；檢測限參考品 37 份，由細胞系樣本和外周血樣本組成，包含 產(chǎn)品可檢出的所有變異類型的最低檢出限水平。?
試劑盒包含 4 份陽性對照品和 1 份陰性對照品，用于檢 測過程的質(zhì)量控制。陰陽性對照品均為細胞系樣本，陽性對 照品涵蓋該產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類型，陰性對照品 為無變異樣本。?
（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
申請人通過對多重 PCR 反應(yīng)引物配比、PCR 反應(yīng)標簽 引物用量、PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件、PCR 產(chǎn)物混合比例、 陽性對照檢測方式、文庫制備起始量、純化磁珠用量、打斷 參數(shù)、末端修復(fù)反應(yīng)體系、末端修復(fù)反應(yīng)時間、加 A 反應(yīng)體 系、連接反應(yīng)體系、篩選磁珠用量、樣本有效序列數(shù)、上機 文庫數(shù)等條件進行篩選和優(yōu)化，通過功能性試驗，最終確定 了最佳的生產(chǎn)工藝與反應(yīng)體系。?
分析性能評估包括核酸提取試劑性能研究、準確度、重 復(fù)性、精密度、分析特異性、分析靈敏度等性能評估。針對核酸提取試劑性能研究，申請人采用臨床樣本平行 比較了核酸純化試劑和核酸提取試劑的提取性能，通過對比 提取所得 DNA 的濃度和純度，確定核酸提取試劑為該產(chǎn)品 的配套提取試劑。?
準確度評估中，申請人分別在兩種適配機型（基因測序 儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））上使用 三批試劑盒對企業(yè)參考品盤中的 37 份陽性參考品進行檢測， 陽性符合率為 100%。另外，申請人分別在兩種適配機型（基 因測序儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200）） 上使用一批試劑盒對已知臨床檢測結(jié)果的臨床樣本進行檢 測，試劑盒檢測范圍內(nèi)各變異類型的陽性符合率、陰性符合率和總符合率均為 100%。精密度評估中，申請人使用三批試劑盒對臨界濃度 10 ng/μL 和中高濃度 15 ng/μL 的 5 份外周血樣本和 1 份細胞系 樣本在兩個實驗室由兩組操作者在不同適配機型（基因測序 儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））的不同 儀器上進行檢測，每個濃度的每個樣本重復(fù)檢測 3 次，連續(xù) 檢測 20 天。檢測結(jié)果均與已知結(jié)果一致。分析特異性評估中，申請人分別在兩種適配機型（基因 測序儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））上使用三批試劑盒對企業(yè)參考品盤中的 14 份陰性參考品進行 檢測，陰性符合率為 100%；對 Hb Q-Thailand、Hb New York、 Hb J-Bangkok 等具有同源性序列的血紅蛋白異常樣本和-- FIL、-α21.9、Hb Lepore-Boston-Washington 等檢測范圍外的 地貧變異陽性樣本進行檢測，檢測結(jié)果均為未檢出檢測范圍 內(nèi)的基因變異；對梯度稀釋的血紅素、甘油三酯、膽紅素、 肝素鈉、EDTA?K2、甲磺酸去鐵胺、地拉羅司分散片、葉酸 片和愛樂維（復(fù)合維生素片）、布洛芬、鹽酸氨溴索、蒲地藍 消炎膠囊、頭孢克肟干擾樣本進行檢測，檢測結(jié)果表明，當(dāng) DNA 樣本中血紅素濃度≤200g/L、甘油三酯濃度≤1000 mg/dL、膽紅素濃度≤2 mg/dL、EDTA?K2 濃度≤2.5 mg/mL、 甲磺酸去鐵胺濃度≤1.6 mg/mL、地拉羅司濃度≤1.6 mg/mL、葉酸濃度≤0.38 mg/L、愛樂維(復(fù)合維生素)平均濃度 ≤35.6 mg/L、布洛芬濃度≤0.143mg/mL、鹽酸氨溴索濃度≤ 0.12mg/mL、頭孢克肟濃度≤0.286mg/mL、蒲地藍消炎膠囊 濃度≤2.86mg/mL 時，干擾物質(zhì)對試劑盒檢測結(jié)果無明顯影響，試劑盒具有較好的抗干擾能力。當(dāng)樣本中的肝素鈉濃度 在 2IU/mL 以上時，試劑盒檢測失敗率高，試劑盒不適用于 檢測肝素鈉抗凝采血管采集的樣本，樣本采集應(yīng)選用 EDTA?K2 抗凝采血管。最低檢測限研究中，申請人分別在兩種適配機型（基因 測序儀（MGISEQ-2000）和基因測序儀（MGISEQ-200））上 進行了研究。
首先選擇產(chǎn)品可檢出的 4 種代表性變異類型的 細胞系樣本進行梯度稀釋，每個濃度梯度樣本重復(fù)檢測 3 次， 將具有 100%檢出率的最低濃度設(shè)定為預(yù)估最低檢測限。之 后，將包含所有申報位點的雜合型樣本稀釋至預(yù)估最低檢測 限濃度，每個樣本重復(fù)檢測 20 次，將檢測結(jié)果為相應(yīng)的基因 型別且每個型別的檢出率均≥95%時濃度，設(shè)定為最低檢測 限濃度。最后，申請人使用三批試劑盒對各個申報位點的雜 合型樣本進行重復(fù)檢測 20 次，驗證了最低檢測限。（四）陽性判斷值?
申請人使用該產(chǎn)品對 329 例已有地貧基因檢測結(jié)果的臨床樣本進行檢測，對非缺失型的陽性樣本進行突變頻率的統(tǒng)計分析，基于理論雜合突變頻率和純合突變頻率，利用 Tukey’s 檢驗確定非缺失型的陽性判斷值；對缺失型陽性樣本 和陰性樣本進行歸一化序列的統(tǒng)計分析，利用 k-medians 聚 類算法確定缺失型的陽性判斷值。?
申請人使用該產(chǎn)品對 428 例已有地貧基因檢測結(jié)果的臨 床樣本進行陽性判斷值的驗證。結(jié)果顯示陽性符合率、陰性 符合率和總符合率均為 100%，Kappa 系數(shù)均為 1。建立的陽 性判斷值能準確判斷檢測范圍內(nèi)的 25 種地貧變異類型的陰、 陽性。?
為考核該產(chǎn)品在不同條件下性能的穩(wěn)定性狀況，為試劑 盒的包裝、運輸、使用和保存條件的確定和有效期的建立提 供依據(jù)，申請人進行了穩(wěn)定性研究，包括效期穩(wěn)定性、凍融 穩(wěn)定性等。研究結(jié)果表明：包裝盒 1 與包裝盒 2 置于-18℃以 下保存，包裝盒 3 置于 2℃～8℃保存，有效期為 12 個月；包裝盒 1、包裝盒 2 凍融 6 次仍可有效檢測；試劑盒每天開 瓶 1 次連續(xù)開瓶 7 天、每 2 天開瓶 1 次連續(xù) 2 周、每周開瓶 1 次連續(xù) 4 周、每月開瓶 1 次 4 個月內(nèi)開瓶小于 4 次仍可有 效檢測。?
適用樣本穩(wěn)定性研究：為考察該產(chǎn)品對不同條件下儲存 不同時間的樣本的檢出性能，申請人使用該產(chǎn)品分別對短期儲存、長期儲存的樣本進行測試，最終確定外周血樣本在室 溫下儲存 9 天、在 2℃～8℃儲存 14 天、在-18℃以下儲存 9 個月仍可有效檢測；樣本反復(fù)凍融次數(shù)應(yīng)不超過 6 次；樣本 在 2℃~8℃運輸時，運輸時間不超過 8 天。?
三、臨床評價概述?
申請人在郴州市第一人民醫(yī)院、珠海市婦幼保健院、云 南省第一人民醫(yī)院共三家臨床機構(gòu)完成了臨床試驗。針對已 有同類產(chǎn)品產(chǎn)品上市的基因型，采用試驗體外診斷試劑與已 上市同類產(chǎn)品進行比較研究；針對尚無同類產(chǎn)品上市的基因 型，采用試驗體外診斷試劑與 Sanger 測序法進行比較研究。?
臨床試驗的樣本類型為外周血。入組病例包括具有地貧癥狀 和/或體征的疑似地貧患者、血液學(xué)表現(xiàn)為小細胞低色素的疑 似地貧患者、臨床考慮為地貧攜帶者、需與地貧進行鑒別診 斷的其他疾病患者等。對于尚無同類產(chǎn)品上市的基因型，提 交了支持該基因型臨床意義的臨床試驗資料及相關(guān)文獻。臨床試驗共入組受試者 1108 例。有效樣本中陽性樣本 1034 例。各基因型別的陽性樣本情況如下：α-地貧缺失型 434 例，β-地貧缺失型 7 例，α-地貧非缺失型 252 例，β-地貧非缺 失型 723 例。?
臨床試驗結(jié)果顯示，該產(chǎn)品檢測范圍內(nèi)的 25 個基因型 別的檢測結(jié)果與對比試劑/Sanger 測序法相比的陽性符合率均為 100%、陰性符合率均為 100%、總符合率均為 100%。綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗試劑符合《體外診斷試劑臨 床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》和《地中海貧血相關(guān)基因檢測試劑注 冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。臨床試驗結(jié)果顯示該產(chǎn) 品與已上市同類產(chǎn)品一致性較好。?
四、產(chǎn)品收益風(fēng)險判定?
根據(jù)申請人提供的申報資料，經(jīng)綜合評價，在目前認知 水平上，認為該產(chǎn)品的上市為適用人群帶來的受益大于風(fēng)險。但為保證用械安全，基于對主要剩余風(fēng)險的規(guī)避，需要在說 明書中提示以下信息：1.本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，不能作為診斷的 唯一依據(jù)。對患者的臨床診斷應(yīng)結(jié)合臨床癥狀/體征、病史、 其他實驗室檢查等情況綜合考慮；2.本試劑盒適用于人的外周血樣本檢測，不適用于其它 樣本檢測；3.本試劑盒可以對 4 種缺失型 α-地中海貧血、2 種缺失 型 β-地中海貧血、3 種非缺失型 α-地中海貧血和 16 種非缺 失型 β-地中海貧血進行檢測，但仍有檢測范圍之外的變異， 可能造成漏檢，這類樣本可用其他方法進一步驗證。4.不合理的樣本采集、運送、處理、核酸過度降解以及未經(jīng) 驗證的其他干擾或 PCR 抑制因子等均有可能會導(dǎo)致假陰性 或假陽性結(jié)果。
綜合評價意見?
本申報項目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊，申請人的 注冊申報資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》 （國務(wù)院令第 739 號）、《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》 （國家市場監(jiān)督管理總局令第 48 號）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī) 與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評價后，建議準予注冊。?
