受理號：CSZ1900370
體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術(shù)審評報(bào)告
產(chǎn)品中文名稱：SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）?
產(chǎn)品管理類別：第三類?
申請人名 稱：北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司
國家藥品監(jiān)督管理局
醫(yī)療器械技術(shù)審評中心
基本信息
一、申請人名稱 北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司
二、申請人住所 北京市昌平區(qū)科技園區(qū)白浮泉路10號2號樓北控科技大廈3層302室?
三、生產(chǎn)地址 北京市昌平區(qū)科技園區(qū)白浮泉路10號2號樓北控科技大廈3層302室、北京市昌平區(qū)超前路37號1幢4層5-4-2-01
技術(shù)審評概述
一、產(chǎn)品概述?
（一）產(chǎn)品主要組成成分 產(chǎn)品主要組成成分見下表：
??
（二）產(chǎn)品預(yù)期用途
本試劑盒用于體外檢測人外周血血漿中SHOX2、RASSF1A、PTGER4基因的甲基化。
本產(chǎn)品用于臨床上對疑似肺癌患者的輔助診斷，檢測結(jié)果陽性不作為肺癌早期診斷或確診的證據(jù)，檢測結(jié)果陰性也不能排除肺癌的可能。該檢測不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)，不宜用于普通人群的腫瘤篩查。SHOX2 屬于 SHOX 基因家族，在胚胎形成期對骨骼、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育作用重大，在肺癌、乳腺癌和腎癌中異常表達(dá)。RASSF1A 調(diào)控涉及基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能，可以通過多種途徑抑制腫瘤形成。PTGER4 屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體家族，是非常重要的抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血漿樣本中 SHOX2、RASSF1A 及 PTGER4三基因啟動子區(qū)域呈高度甲基化。
（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格
30 人份/盒。
（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理
提取血漿中的游離 DNA，然后用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化未發(fā)生甲基化的胞嘧啶，通過脫氨基反應(yīng)產(chǎn)生尿嘧啶磺酸鹽，發(fā)生甲基化的胞嘧啶則不會被亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。將亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的 DNA（BisDNA）做多重 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)中的引物、探針能區(qū)分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優(yōu)先得到擴(kuò)增，與甲基化 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 基因序列特異性結(jié)合的熒光素探針可以在 PCR 反應(yīng)中專一地檢測出甲基化序列。內(nèi)參對照ACTB（β-actin）基因用于評估檢測中 DNA 量是否足夠。
二、臨床前研究概述
（一）主要原材料
1.主要原材料的選擇
本產(chǎn)品的主要原材料包括引物干粉、PCR反應(yīng)液、人類基因組DNA和Hela細(xì)胞基因組DNA。這些原料均是通過外購的方式獲得。
其中引物的序列均由申請人自行設(shè)計(jì)，由合成公司經(jīng)過合成、修飾、純化方式獲得；PCR反應(yīng)液由供應(yīng)商化學(xué)合成獲得；人類基因組DNA和Hela細(xì)胞基因組DNA由供應(yīng)商提取純化獲得。
申請人對主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。
2.企業(yè)參考品設(shè)置情況
本產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測限參考品，組成如下：
陽性參考品包括 12種。P1、P2、P3為一定 DNA 濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均為甲基化的不同甲基化比例的參考品；SP1、SP2、SP3為一定 DNA 濃度不同比例的SHOX2單甲基化參考品；RP1、RP2、RP3為一定 DNA 濃度不同比例的RASSF1A單甲基化參考品；PP1、PP2和PP3為一定DNA 濃度不同比例的PTGER4單甲基化參考品。陰性參考品包括 4種，包括三種不同DNA濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4均無甲基化的參考品，一種三基因均甲基化但甲基化比例低于檢測限的陰性參考品。精密度參考品包括6種。J1、J2為一定DNA 濃度，SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。SJ1、SJ2為一定DNA 濃度，SHOX2單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。RJ1、RJ2為一定DNA 濃度，RASSF1A單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。PJ1、PJ2 為一定DNA 濃度，PTGER4基因單甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。
檢測限參考品包括 4 種。包括低 DNA 濃度的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4三基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的SHOX2單基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的RASSF1A單基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的 PTGER4單基因甲基化參考品。
（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
申請人對試劑盒反應(yīng)體系的研究中包括引物探針濃度的確定、PCR 反應(yīng)液的選擇、陰/陽性質(zhì)控品配方的確定等；對PCR過程中的退火溫度進(jìn)行研究；完成樣本的用量以及樣本保存時(shí)間 的 研 究 ；對 該 產(chǎn) 品 三 種 適 用 機(jī) 型 宏 石 PCR 分 析 系 統(tǒng)SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480的反應(yīng)程序及分析條件進(jìn)行了研究。
通過功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。申請人根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。
（三）分析性能評估
本產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括：準(zhǔn)確性（陽性符合率、陰性符合率）、精密度、檢測限、分析特異性的評估；核酸提取試劑的性能評估；三種適用的 PCR 儀機(jī)型（宏石 PCR 分析系統(tǒng)SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480）評估。
準(zhǔn)確性研究使用企業(yè)陰/陽性參考品及臨床樣本來源的陰性/陽性/弱陽性樣本池分別對三個(gè)批次的試劑盒進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示陽性符合率 100%、陰性符合率 100%。同時(shí)用試劑盒與同類對比試劑分別檢測臨床樣本，包括各期肺癌樣本共 128 例及肺結(jié)核樣本 32 例，結(jié)果顯示試劑盒對于Ⅰ~Ⅳ期肺癌和肺結(jié)核樣本監(jiān)測的準(zhǔn)確率分別為 78.13%、87.50%、84.38%、87.50%和81.25%。
精密度的研究使用了兩種不同的樣本，第一種樣本是精密度參考品，對三批次試劑盒分別在三種適用的儀器上進(jìn)行檢測。
檢測結(jié)果顯示試劑盒檢測的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 和ACTB 基因的變異系數(shù)均小于 10%。第二種樣本是通過在臨床正常人血漿樣本中添加一定濃度的細(xì)胞系 DNA 模擬精密度企業(yè)參考品進(jìn)行驗(yàn)證，檢測結(jié)果顯示 SHOX2、RASSF1A、PTGER4和 ACTB 基因的變異系數(shù)均小于 10%。同時(shí)也對配套用核酸提取試劑的精密度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在樣本采集過程、核酸提取過程中 DNA 提取量變異系數(shù)小于 10%；核酸轉(zhuǎn)化過程中，ACTB 基因 Ct 值的變異系數(shù)均小于 10%。檢測限研究，以陰性血漿樣本為基質(zhì)，對不同游離 DNA 濃度下含有不同比例甲基化 DNA 的血漿樣本進(jìn)行檢測，得到血漿樣本的檢測限，并在三種適用機(jī)型上進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明試劑盒可檢測血漿中陽性 DNA 最低濃度為 0.1pg/?L。在血漿 DNA濃度為 0.02ng/?L 時(shí)，產(chǎn)品檢測 P 值為陽性的檢測限為 0.5%三基因甲基化，單基因甲基化的檢測限分別為 0.2%的 SHOX2 甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。使用三批試劑盒對四種檢測限參考品進(jìn)行檢測驗(yàn)證，結(jié)果表明對于DNA濃度為0.02ng/?L的參考品，P值為陽性的檢測限為0.5%的三基因甲基化，單基因甲基化的檢測限分別為 0.2%的 SHOX2甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。特異性研究，交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明試劑盒檢測干擾樣本的綜合特異性超過 85%。對于發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的其它原發(fā)癌癥（包括肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌）檢出率較低，假陽性率低于 25%，說明產(chǎn)品僅適用于原發(fā)性肺癌的檢測。檢測自身免疫性疾病包括紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特異性超過 90%，假陽性率低于 10%。檢測其它肺部疾病的特異性超過 85%，假陽性率低于 15%。檢測宮頸癌特異性為 80%，假陽性率為 20%。
干擾實(shí)驗(yàn)顯示，樣本中含有以下干擾物：未甲基化 DNA（150ng/ml）、膽紅素（0.20mg/ml）、血紅蛋白（10mg/ml）、甘油三酯（12mg/ml）、蛋白（血清白蛋白，120mg/ml）、紅細(xì)胞（0.4% v/v）、K2EDTA（20mg/ml）、膽固醇（5mg/ml）、尿酸（0.235mg/ml）和葡萄糖（10mg/ml），對檢測結(jié)果無影響。常見治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮(zhèn)痛藥等在最大使用劑量范圍內(nèi)，不影響試劑盒對樣本檢測的 Ct 值及 P 值判定。
對與試劑盒聯(lián)合使用并在說明書中推薦的血漿樣本處理試劑（核酸提取試劑，京昌械備 20180004 號，北京艾克倫醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行了性能評估，結(jié)果表明產(chǎn)品配套使用的核酸提取試劑，提取效率、保護(hù)效率和轉(zhuǎn)化效率分別為 85.18%、93.52%和 99.32%。
對該產(chǎn)品適用的三種儀器宏石 PCR 分析系統(tǒng) SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480 進(jìn)行了性能評估，結(jié)果顯示在三種適用機(jī)型上的陰/陽性符合率、檢測限、精密度均符合質(zhì)量要求，可以作為該產(chǎn)品的檢測 PCR 儀。
（四）陽性判斷值研究
申請人采用三基因擬合 P 值公式法確定陽性判斷值。每個(gè)樣本進(jìn)行 3 次 PCR 平行測試，計(jì)算 SHOX2、RASSF1A、PTGER4和 ACTB 基因 3 個(gè)復(fù)孔平均 Ct 值，其中各個(gè)基因無擴(kuò)增時(shí)，Ct值定義為 45.0。ACTB 基因的 Ct 值≤35.0 時(shí)，樣本檢測結(jié)果有效。在確定樣本檢測結(jié)果有效的情況下，樣本 P 值≥2.0 則判斷樣本為陽性，樣本 P 值＜2.0 則判斷樣本為陰性。
陽性判斷值研究入組（訓(xùn)練集和驗(yàn)證集）有效樣本數(shù)共計(jì)489 例，包括肺部正常樣本 207 例、肺癌病人樣本 141 例、其它干擾樣本（包括結(jié)節(jié)、肺炎、肺結(jié)核、囊腫、食管癌、胃癌等）141 例。樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行多種方法統(tǒng)計(jì)分析，包括 1/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、2/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、3/3 次 PCR 反應(yīng) Ct 值、3 次PCR 反應(yīng)平均 Ct 值、單基因、兩基因、三基因、三基因組合擬合公式等，比較不同分析方法的檢測靈敏度、特異性、總符合率，最終確定使用三基因擬合 P 值公式法檢測準(zhǔn)確率最高。并使用測試集樣本再次驗(yàn)證三基因擬合公式和其他陽性判斷值方法，測試集研究入組有效例數(shù) 248 例，包括肺部正常人樣本 81例，肺癌病人樣本 76 例，其他干擾樣本 91 例。結(jié)果表明三基因擬合 P 值公式法特異性為 94.19%（95%CI：90.65%-97.72%），靈敏度為 89.47%（95%CI：82.41%-96.53%），總符合率為 92.74%（95%CI：89.49%-95.99%）。
（五）穩(wěn)定性研究
申請人對該產(chǎn)品的穩(wěn)定性的研究包括長期穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性（包括開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性）及樣本穩(wěn)定性（包括全血、血漿及 BisDNA 的穩(wěn)定性）。長期穩(wěn)定性：選擇三批次試劑盒置于-20±5℃冰箱中保存，在儲存后的第 0、3、6、9、12、13、14、15 個(gè)月進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示產(chǎn)品在生產(chǎn)后 15 個(gè)月的產(chǎn)品性能符合技術(shù)要求，試劑性能穩(wěn)定。確定產(chǎn)品有效期可達(dá) 12 個(gè)月。
使用穩(wěn)定性：將三批試劑盒置于-20±5℃開瓶放置 6 周后，穩(wěn)定性結(jié)果 P 值及 CV 值均無顯著差異，無顯著變化趨勢，其產(chǎn)品的主要性能均符合技術(shù)要求。將三批次試劑盒在規(guī)定的儲存條件下，取出試劑盒反復(fù)凍融 6 次，檢測每次凍融后的試劑盒的性能均符合技術(shù)要求。將三批試劑盒置于 37℃，分別于 1天、2 天、3 天后檢測產(chǎn)品性能，均符合技術(shù)要求。申請人對全血樣本、血漿樣本及 BisDNA 的樣本穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明使用 EDTA 抗凝管（BDVacutainer?，6mL，國械注進(jìn) 20152222083）采集全血，建議選用 2-8℃放置4 小時(shí)以內(nèi)的新鮮血樣分離血漿后用于檢測；使用康為游離DNA 采血管（康為世紀(jì)，5mL，蘇械注準(zhǔn) 20192220059）采集全血，建議選用室溫放置 4 天以內(nèi)的血樣分離血漿后用于檢測。分離后的血漿樣本建議在-20±5℃保存 30 天以內(nèi)，在 2-8℃保存12 小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行檢測；BisDNA 保存期限為在-20±5℃保存 4 天以內(nèi)，在 2~8℃保存 16 小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行 PCR 檢測。
三、臨床評價(jià)概述
本產(chǎn)品在上海市東方醫(yī)院、山西省腫瘤醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院三家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，采用試驗(yàn)體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較研究，確認(rèn)本產(chǎn)品的臨床性能。其中，肺癌和其他腫瘤病例采用病理診斷確診，其他疾病根據(jù)相關(guān)診療指南采用病理診斷或 CT 等綜合診斷確診。入組病例為肺癌疑似病例，樣本類型為血漿。產(chǎn)品臨床靈敏度和特異度評價(jià)共納入臨床病例 1303 例，其中肺癌病例 486 例（覆蓋肺癌所有分期及所有病理分型），非肺癌的其他病例 817 例（包括其他易產(chǎn)生干擾的腫瘤及各種良性疾病病例）。試驗(yàn)結(jié)果顯示：本產(chǎn)品臨床靈敏度為 86.83%（95%CI：83.53%～89.55%），特異度 95.59%（95%CI：93.96%～96.80%），總符合率為 92.33% （95%CI：90.75%～93.65%） 。上述結(jié)果顯示試驗(yàn)體外診斷試劑具有較好的臨床靈敏度和特異度，滿足臨床使用需求。?
此外，臨床試驗(yàn)還納入 260 例肺癌疑似病例（包括本產(chǎn)品與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果不符樣本），采用試驗(yàn)體外診斷試劑與一代測序進(jìn)行比較研究，確認(rèn)本產(chǎn)品的臨床檢測性能。試驗(yàn)結(jié)
果顯示：針對 SHOX2 基因，陽性符合率為 100%（95%CI：97.37%～100%），陰性符合率為 98.31%（95%CI：94.03%～99.53%），總符合率為 99.23%（95%CI：97.24%～99.79%）；針對 RASSF1A 基因，陽性符合率為 100%（95%CI：97.24%～100%），陰性符合率為 98.28%（95%CI：93.93%～99.53%），總符合率為 99.23%（95%CI：97.24%～99.79%）；針對 PTGER4基因，陽性符合率為 100%（95%CI：96.97%～100%），陰性符合率為 98.54%（95%CI：94.83%～99.60%），總符合率為 99.23%（95%CI：97.24%～99.79%）。上述結(jié)果顯示兩者之間具有良好的一致性，本產(chǎn)品臨床檢測性能滿足要求。?
另外，采用試驗(yàn)體外診斷試劑對 37 例肺癌患者手術(shù)前后的樣本進(jìn)行連續(xù)檢測，35 例樣本術(shù)前檢測結(jié)果為陽性，術(shù)后檢測結(jié)果為陰性；2 例樣本術(shù)前術(shù)后檢測結(jié)果均為陰性，表明肺癌手術(shù)切除后血漿中甲基化水平降低。
綜上所述，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示本產(chǎn)品的臨床性能滿足技術(shù)審評要求。
四、產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定
根據(jù)申請人提供的申報(bào)資料，經(jīng)綜合評價(jià)，在目前認(rèn)知水平上，認(rèn)為該產(chǎn)品上市帶來的受益大于風(fēng)險(xiǎn)。但為保證用械安全，基于對主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的規(guī)避，需要在說明書中提示以下信息：
1.使用普通 EDTA 真空采血管采集后的血樣應(yīng)立即分離血漿，若不能立即分離血漿，應(yīng)在 2~8℃保存，保存時(shí)間不超過 4小時(shí)；使用游離 DNA 采血管采集后的血漿可以室溫保存 4 天。不得冰凍血樣。
2.禁止使用離心機(jī)剎車（急停）功能，以防止破壞血細(xì)胞層。
3.制備好的血漿樣本可以在-20±5℃下保存不超過 30 天可以在 2~8℃存放不超過 12 小時(shí)。
4.BisDNA 不立即使用，可在 2~8℃保存 16 小時(shí)，或在-20±5℃保存 4 天。
5.PCR 反應(yīng)液和引物混合液使用完畢立即復(fù)凍。
6.密封后的 PCR 管可在 2~8℃放置不超過 2 小時(shí)。
7.只能用于體外診斷。
8.該產(chǎn)品的有效性僅針對于 EDTA 抗凝采血管。對于其它血樣的收集方式有效性沒有做測試。
9.該產(chǎn)品的使用者應(yīng)該是接受過 PCR 反應(yīng)訓(xùn)練的試驗(yàn)者。
10.由于肺癌檢測依賴于樣品中腫瘤 DNA 的量，所以可能受樣品收集過程、樣品儲存方式、病人個(gè)體因素（如年齡，其它疾?。┮约澳[瘤級別影響，外周血的采集、血漿的制備和存儲均應(yīng)按照要求進(jìn)行，否則將影響檢測結(jié)果，導(dǎo)致假陰性的檢測結(jié)果。
11.由于血漿樣本中游離 DNA 含量低、易降解，應(yīng)嚴(yán)格按照【樣本要求】的規(guī)定處理和保存樣本，否則影響檢測，造成假陰性結(jié)果。
12.由于擴(kuò)增的初始靶 DNA 含量極低，故擴(kuò)增循環(huán)數(shù)較長。應(yīng)盡量避免檢測環(huán)境的污染，否則容易在擴(kuò)增循環(huán)末期產(chǎn)生假陽性信號。
綜合評價(jià)意見
本申報(bào)項(xiàng)目為境內(nèi)第三類體外診斷試劑產(chǎn)品注冊，屬于境內(nèi)同品種首個(gè)產(chǎn)品。申請人的注冊申報(bào)資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國務(wù)院令第 680 號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令 2014 年第 5號）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評價(jià)后，建議準(zhǔn)予注冊。
2022 年 1 月 29 日
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