在之前的文章中已經(jīng)探討了擴增試劑、PCR儀、提取試劑乃至采樣拭子的評價方式。今天我們繼續(xù)探討PCR實驗室最容易忽視的環(huán)節(jié)，對試驗輔料進行質(zhì)檢。PCR實驗室的輔料指的是PCR實驗中常用的一些輔助試劑和耗材，比如采樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等。

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輔料質(zhì)檢的基本原則

輔料的質(zhì)檢通常是在新一批的輔料到實驗室后統(tǒng)一做一次或者定期（半年或1年）做，因此質(zhì)檢就包含了驗貨和質(zhì)檢2個部分。由于輔料的質(zhì)檢沒有一個統(tǒng)一的標準，一般由各實驗室自行制定，可簡可繁，這里提出一些方法供大家參考和批評指正。

1.外包裝檢查：外包裝應完整無損無污，標識清楚，檢查品名、品牌，貨號，規(guī)格、生產(chǎn)日期，有效期、保存條件等信息。

2.內(nèi)包裝檢查：內(nèi)包裝物品應與外包裝標識一致，檢查是否有破損，泄漏，內(nèi)容物是否齊全，是否有相應的使用說明書等。

3.性能質(zhì)檢：檢測試劑耗材是否與其性能一致，比如吸頭的準確性和氣密性等

4.污染物質(zhì)檢：檢測試劑耗材是否被常規(guī)檢測項目的待檢物污染，這種污染可能是物品生產(chǎn)環(huán)節(jié)，也可能是運輸或實驗室的保存過程中被污染。

5.抑制物質(zhì)檢：檢測試劑耗材中是否存在PCR反應的抑制物，比如核酸酶。

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輔料質(zhì)檢的前提條件

1.弱陽性質(zhì)控：需要準備弱陽性質(zhì)控，包括標準物質(zhì)、第三方質(zhì)控或弱陽性樣品用于進行性能質(zhì)控和抑制物質(zhì)控。

2.陰性質(zhì)控：需要準備確定陰性的樣品或空白對照，用于進行污染物的質(zhì)控。

3.重復次數(shù)n：中國人喜歡3(三顧茅廬),6（六六大順）,8（發(fā)發(fā)發(fā)）,9（九九歸一），很遺憾這些數(shù)和實驗室都關系不太大。符合統(tǒng)計學計算的最常用的兩個數(shù)字是5和20,5通常是能進行統(tǒng)計學分析的最少重復次數(shù)，20通常用于計算95%的置信區(qū)間。大家根據(jù)自己的需要選擇合適的重復次數(shù)。

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常見輔料的質(zhì)檢

輔料的質(zhì)檢應結合實際工作中可能用到的場景，并非越苛刻越好，需要每個實驗室結合自身情況來設計和調(diào)整文中提到的參數(shù)。

1.離心管：

（1）滲漏密閉性：將n個離心管加入半量墨汁，蓋好蓋子后放入水中，浸泡30min，沒有墨汁滲出為合格。

（2）離心密閉性：將n個離心管加入半量純水，放入離心機，10000 rpm，30min，管蓋未崩開未漏液為合格。

（3）熱密閉性：將n個離心管加入半量純水，蓋好蓋子稱重后放入金屬浴中，65℃或90℃（巴氏消毒），30min，再進行稱重，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液，前后重量未變化為合格。。

（4）冷密閉性：將n個離心管加入半量純水，放入-20℃冰箱，24h，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液為合格。

（5）污染物質(zhì)檢：將n個離心管分別加入半量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min后靜置5min，吸取純水作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（6）抑制物質(zhì)檢：將n個離心管分別加入弱陽性質(zhì)控物,室溫靜置5min，然后進行提取;RNA核酸，DNA核酸，室溫靜置5min，作為模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制為合格。

2.PCR管：

（1）滲漏密閉性：將n個PCR管加入半量墨汁，蓋好蓋子后放入水中，浸泡30min，沒有墨汁滲出為合格。

（2）離心密閉性：將n個PCR管加入半量純水，放入離心機，1000 rpm，30min，管蓋未崩開未漏液為合格。

（3）熱密閉性：將n個PCR管加入半量純水，蓋好蓋子稱重后放入PCR儀，設置一個常用的PCR程序，程序運行完畢后，再進行稱重，PCR管未變形，管蓋未崩開未漏液，前后重量未變化為合格。。

（4）冷密閉性：將n個PCR管加入半量純水，放入-20℃冰箱，24h，離心管未變形，管蓋未崩開未漏液為合格。

（5）污染物質(zhì)檢：將n個PCR管加入半量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min后靜置5min，作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（6）抑制物質(zhì)檢：將n個PCR管分別加入弱陽性質(zhì)控物,室溫靜置5min，然后進行提取;RNA核酸，DNA核酸，室溫靜置5min，作為模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制為合格。

（7）空白熒光通透性：對于qPCR,需要考察PCR管是否有非特異性熒光信號，將n個空PCR管，蓋好蓋子后放入PCR儀，設置一個常用的PCR程序，程序運行完畢后，qPCR無擴增為合格。

（8）陽性熒光通透性：對于qPCR,還需要考察PCR管是否會抑制熒光的通透性，將n個含弱陽性樣品和擴增試劑的PCR管，與確認無熒光干擾的PCR管，蓋好蓋子后放入PCR儀一同擴增，設置一個常用的PCR程序，程序運行完畢后，qPCR擴增未被抑制為合格。

3.濾芯吸頭：測試吸頭需使用經(jīng)校準的移液器

（1）準確性：將n個吸頭分別吸取定量的純水稱重，重量與體積的關系按照1 g/mL換算。

（2）氣密性：取n個吸頭，吸取最大量程的含有1％甘油的墨水，觀察有色液體不出現(xiàn)在濾塞之上，液面相同為合格。

（3）防氣溶膠性能：取n個吸頭，吸取陽性核酸，反復吹吸10次，換另一個新吸頭在陰性純水中反復吹吸10次，取陰性純水作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（4）污染物質(zhì)檢：取n個吸頭，吸取陰性純水反復吹吸10次，取陰性純水作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（5）抑制物質(zhì)檢：取n個吸頭，吸取弱陽性質(zhì)控物反復吹吸10次，然后進行提取;吸取RNA核酸和DNA核酸反復吹吸10次，作為模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制為合格。

4.采血管、采樣管、采樣拭子和一次性吸管等：主要考察污染物和抑制物

（1）污染物質(zhì)檢：將n個耗材加入一定量陰性純水，蓋好蓋子渦旋1 min后靜置30min，吸取純水作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（2）抑制物質(zhì)檢：將n個耗材分別加入弱陽性質(zhì)控物,室溫靜置30min，然后吸取質(zhì)控物進行提取;作為模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制為合格。

5.無核酸酶水、PBS等緩沖液：

（1）PH值：測量各緩沖液的PH值。

（2）污染物質(zhì)檢：吸取緩沖液作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（3）抑制物質(zhì)檢：將緩沖液分別與RNA核酸和DNA核酸混合，然后吸取混合液作為模板進行擴增，qPCR擴增未被抑制為合格。

6.移液器和離心管架及離心機的內(nèi)外表面：這些常見物品的外表面容易被核酸和細菌污染，主要查看這兩個指標。

（1）表面核酸污染：用沾濕的拭子擦拭上述物品的外表面，然后浸泡到純水中10min，吸取純水作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（2）移液器內(nèi)腔核酸污染：對于常用的移液器的內(nèi)部，可使用無濾芯的吸頭在陰性純水中吹吸10次后，吸取純水作為模板進行擴增，qPCR無擴增為合格。

（3）表明細菌污染：用沾濕的無菌拭子擦拭上述物品的外表面，劃瓊脂平板，每個平板的菌落數(shù)不應超過一定數(shù)量（我也不確定多少合適，由于不要求無菌操作一定會有細菌，但是也不應該太多）。

非瘟和新冠后全國一下子新增了很多核酸檢測實驗室，早期大家關注的點都在設施和硬件上，但是一個檢測實驗室開展大量檢測工作之后，檢測中最弱的環(huán)節(jié)決定檢測的質(zhì)量。我們也需要將精力放在檢測中的每個細節(jié)上。