醫(yī)械創(chuàng)新資訊
新冠疫情爆發(fā)以來，如何快速高效檢測出新冠病毒成了全球關注的焦點。雖然基于血清學的檢測快速且僅需要少量的設備，但由于患者可能在癥狀發(fā)作之后的數(shù)天甚至數(shù)周才會產(chǎn)生可檢測的抗體，所以其實用性有限。而目前全球大量科研團隊都在研究和開發(fā)基于CRISPR-Cas9的新冠病毒檢測技術(shù)，竟然和早孕測試差不多？
?一、CRISPR技術(shù)簡介
CRISPR-Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御機制，可用來對抗入侵的病毒降解外源 DNA。該系統(tǒng)由 Cas9核酸酶和確定靶向序列的RNA復合體組成，后者由 crRNA和反式激活 RNA(tracrRNA) 組成。?
二、CRISPR技術(shù)的應用
在 實 際 應 用 中，crRNA 和 TracrRNA 可以融合成為一條 RNA( sgRNA) 發(fā)揮功能。簡化后的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由兩部分組成: Cas9 蛋白和 sgRNA。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)展徹底改變了人們編輯 DNA 序列和調(diào)控目標基因表達水平的能力，從而為生物體的精確基因組編輯提供了有力的工具。該系統(tǒng)作用原理為 sgRNA 通過自身的 Cas9 把手與 Cas9 蛋白形成 Cas9-sgRNA 復合體，Cas9-sgRNA 復合體中 sgRNA 的堿基互補配對區(qū)序列與目標基因的靶序列通過堿基互補配對原則進行配對結(jié)合，Cas9 利用自身的核酸內(nèi)切酶活性對目標 DNA 序列進行切割。目前在研的基于CRISPR-Cas9技術(shù)的SARS-CoV-2檢測項目如下圖所示。分別是HERLOCK Bioscience開發(fā)的SHERLOCK技術(shù)，Mammoth Biosciences開發(fā)的DETECTR技術(shù)，康涅尼格大學研究人員開發(fā)的AIOD技術(shù)，加州大學圣芭芭拉分校研究人員開發(fā)的CREST技術(shù)印度CSIR基因及整合生物學研究所研究人員開發(fā)的FELUDA技術(shù)。
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1、SHERLOCK
SHERLOCK是由Sherlock Biosciences和MIT聯(lián)合開發(fā)的一項新冠檢測技術(shù)，Sherlock Biosciences是2019年3月創(chuàng)立的一家生物技術(shù)公司，該公司由張鋒等9位在CRISPR技術(shù)領域和癌癥、傳染疾病診斷技術(shù)領域的專家共同創(chuàng)立，核心技術(shù)由麻省理工學院和哈佛大學授權(quán)，分別是基于基因編輯技術(shù)CRISPR的診斷技術(shù)平臺SHERLOCK，和基于合成生物學的分子診斷平臺INSPECTR。?2020年2月，張鋒教授和他的合作伙伴宣布開發(fā)出一項基于CRISPR的新冠病毒檢測技術(shù)，不需要復雜的設備，三步檢測僅需約1個小時，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13a的蛋白酶和與其結(jié)合的向?qū)NA。根據(jù)新冠病毒的RNA序列，研究人員們精心設計了能夠靶向新冠病毒特異性序列的向?qū)NA。后續(xù)的檢測步驟與市場上的懷孕檢測很相似，將反應后的樣本滴在能夠識別“完整分子”和“切斷分子”的試紙上，如果樣本里不存在新冠病毒，那么試紙標識“完整分子”的較低位置上，就會出現(xiàn)一條條帶。相反，如果樣本里真的有新冠病毒對應的RNA，那么在代表“切斷分子”的較高位置上，會出現(xiàn)另一條條帶。通過條帶位置的不同，我們很容易就能確認新冠病毒的存在與否。?該團隊在2020年5月發(fā)布了一個更新的檢測方法：一步 STOPCovid，這款最新的檢測手段比2月份的檢測技術(shù)更進一步，檢測過程中不需要從患者樣本中純化RNA，并且將檢測新冠病毒所需的化學反應步驟在一個試管中完成。在檢驗12個新冠病毒陽性和5個新冠病毒陰性樣本的實驗中，這一檢測達到100%的特異性和97%的靈敏度。不過科學家們也強調(diào)，這一檢測方法還沒有獲得FDA的批準，尚不能用于臨床上對新冠病毒感染的診斷。一步 STOPCovid 試驗示意圖：
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該團隊還進一步設計了可用于讀取 STOPCovid 試驗結(jié)果的設備盒：取樣至反應管，將密封的反應管置于檢測盒，用戶關閉檢測盒并拉動手柄，樣本在側(cè)向?qū)游鰲l上發(fā)生反應進行檢測，應用手機APP獲取條帶定量強度和相應測試結(jié)果。? ? ? ?
該方法的優(yōu)點在于：在 crRNA/靶基因復合體中存在兩個或多個錯配的情況下，Cas13a 不具有催化活性，所以對于高度相似的病毒不會給出陽性結(jié)果。與DETECTR所使用的 Cas12a 不同，Cas13a 對靶位點沒有嚴格的序列偏好，而 Cas12a 需要 PAM進行靶標切割，限制了使用范圍。2020 年 5 月 7 日，Sherlock Biosciences宣布其已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 對其 Sherlock?CRISPR新冠病毒試劑盒的緊急使用授權(quán) (EUA)，該試劑盒用于檢測引起 COVID-19 的病毒，在大約一小時內(nèi)提供結(jié)果。?2、 DETECTR 新冠病毒
DETECTR是由Mammoth Biosciences和UCSF聯(lián)合開發(fā)的一項新冠檢測技術(shù)，Mammoth Biosciences是一家美國生物技術(shù)公司，它由CRISPR大神Jennifer Doudna創(chuàng)辦，該公司的目標是使其CRISPR驅(qū)動的搜索引擎成為疾病檢測的首選平臺。2020年四月，根據(jù)發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》的一篇研究論文顯示，Mammoth Biosciences和加州大學舊金山分校（UCSF）的科研團隊合作開發(fā)出一種基于CRISPR技術(shù)的診斷工具，可以快速檢測出患者體內(nèi)是否有新冠病毒。論文指出，使用這一技術(shù)大約只需45分鐘就能給出結(jié)果，相比之下，目前基于PCR的核酸檢測需要幾小時甚至幾天才能出結(jié)果，因此新技術(shù)可以大大縮短診斷時間。其檢測步驟和原理如下圖所示：
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在檢測的 83 份已知 COVID 陽性樣本中，DETECTR 的陽性預測率為 95%，陰性預測率為 100%。它也是迄今檢測速度最快的測方法。此法需要進行RNA的提取，Lucia等研究人員對類似的方法進行了優(yōu)化，可直接使用唾液檢測新冠病毒病毒，無需進行 RNA 提取，但僅當唾液中病毒載量足夠高（105 拷貝/μl）時才可能起作用。Mammoth Biosciences日前表示正在與GSK Consumer Healthcare合作，一起將其基于CRISPR的DETECTR平臺設計和制造成一次性家庭測試套件，該套件制造計劃在2020年底前完成。并在今年年底之前將向美國FDA遞交緊急使用授權(quán)（EUA）的申請。
?3、AIOD
該技術(shù)是由康涅尼格大學生物醫(yī)學工程系的Changchun Liu教授團隊發(fā)明。其檢測步驟和原理如下：
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該方法與 SHERLOCK 診斷檢測高度相似，在步驟的順序和使用的 Cas 蛋白方面存在差異。該方法的優(yōu)點在于檢測時反應所需的所有組分混合放置于同一反應體系中，并在單一溫度下孵育。本檢測方法中設計了兩個 Cas12a-crRNA 復合物，使用兩個與兩個區(qū)域結(jié)合的 crRNAs 提高了檢測的靈敏度。且該反應不受 Cas12a 的前間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 的限制。該體系具有接近單分子水平的敏感性。以 HIV-1 和新冠病毒檢測為例，未經(jīng)預擴增的 AIOD檢測體系能夠在 40 min 的孵育中檢測低至 1.2 拷貝的 DNA 靶標和 4.6 拷貝的 RNA 靶標。
4、CREST?該技術(shù)是由加州大學圣芭芭拉分校分子細胞生物學系的Max Wilson，Diego Acosta-Alvear, Carolina Arias教授團隊共同發(fā)明。其檢測步驟和原理如下：
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該技術(shù)使用PCR擴增逆轉(zhuǎn)錄 RNA 樣本，本檢測方法沒有使用典型的 PCR 儀，而是使用以電池供電通過藍牙即可以啟用的簡易PCR 儀。
?5、 FELUDA?
該技術(shù)是由印度CSIR基因及整合生物學研究所的Souvik Maiti 和Debojyoti Chakraborty研究員共同開發(fā)。FELUDA是一種基于FnCas9 的CRISPR技術(shù)，F(xiàn)nCas9 是一種對 DNA 內(nèi)是否存在錯配以及這些錯配的位置高度敏感的蛋白。當存在兩個及以上的堿基錯配時， FnCas9 將不會對靶基因序列進行切割。其檢測步驟和原理如下：
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該方法依賴于其對目標區(qū)域的活性，F(xiàn)nCas9 可在 10-50 ℃ 之間變化的溫度范圍內(nèi)進行切割。
?6、五種檢測方法比較：?
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結(jié)語
在以往的大流行病中，缺乏快速、便捷和準確的診斷測試技術(shù)，是阻礙公共衛(wèi)生部門應對和控制新出現(xiàn)的病毒威脅的主要原因之一。如何開發(fā)具有經(jīng)濟實惠，快速便捷特性的診斷工具，成為我們應對當下正在流行的COVID-19和未來可能突發(fā)的公共衛(wèi)生事件的決勝步驟?；贑RISPR的診斷工具由于其具有準確便捷迅速的特點，可以在幾天內(nèi)進行重新配置以檢測目標病毒。針對這一技術(shù)開發(fā)的診斷方法很有可能會改變以前流行病學檢測的方法。
