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我心目中檢測(cè)技術(shù)史上的幾次革命性發(fā)明分別是基于抗原抗體特異性結(jié)合原理的免疫標(biāo)記技術(shù)，PCR技術(shù)和測(cè)序技術(shù)。今天我們來(lái)聊聊PCR技術(shù)，按照PCR技術(shù)的演進(jìn)，人們習(xí)慣性的將PCR技術(shù)劃分為三代：普通PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)。
一、普通PCR技術(shù)
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普通PCR的優(yōu)點(diǎn)基于毛細(xì)管電泳的PCR
針對(duì)普通PCR的缺點(diǎn)，一些廠家推出了基于毛細(xì)管電泳原理的儀器，將PCR擴(kuò)增后電泳的步驟在毛細(xì)管中完成，靈敏度更高，可以區(qū)分幾個(gè)堿基的差異并且通過(guò)MAERKER可以計(jì)算出擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。缺陷是仍然需要將PCR產(chǎn)物打開(kāi)后放入儀器，仍然存在很大的污染風(fēng)險(xiǎn)。
毛細(xì)管電泳圖
二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time?PCR ，qPCR）技術(shù)?熒光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。熒光定量PCR的發(fā)展史是一部ABI、羅氏和伯樂(lè)等巨頭的蕩氣回腸的斗爭(zhēng)史，感興趣的可以去查查。該技術(shù)是目前最成熟，使用最廣泛的半定量PCR技術(shù)。
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qPCR的優(yōu)點(diǎn)?數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR能夠直接讀出DNA/RNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品核酸分子的絕對(duì)定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。
2006年，F(xiàn)luidigm公司第一個(gè)生產(chǎn)商業(yè)化的基于芯片的dPCR儀。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統(tǒng)，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統(tǒng)，采用高密度的納升級(jí)微流控芯片技術(shù)，將樣本均勻的分配至20 000個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中。
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2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 于 微 滴 的QX100 dPCR儀，利用油包水技術(shù)，將樣品平均分配到20 000個(gè)微滴油包水中，利用微滴分析儀對(duì)微滴進(jìn)行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅(qū)動(dòng)下，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬(wàn)至1 000萬(wàn)個(gè)皮升級(jí)別微滴的反應(yīng)乳液。
至此數(shù)字PCR就形成了2大派別，芯片式和微滴式。不論是哪種數(shù)字PCR，其核心原理都是有限稀釋?zhuān)K點(diǎn)PCR和泊松分布。將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，平均分配成幾萬(wàn)個(gè)PCR反應(yīng)，分配到芯片或微滴中，使每個(gè)反應(yīng)中盡可能含有一個(gè)模板分子，進(jìn)行單分子模板PCR反應(yīng)，通過(guò)讀取熒光信號(hào)的有或無(wú)進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)泊松分布的校準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)定量。
1.Bio-Rad QX200?微滴式數(shù)字PCR
伯樂(lè)QX200是一個(gè)很經(jīng)典的數(shù)字PCR平臺(tái)，基本的檢測(cè)流程：通過(guò)微滴生成儀生成20000個(gè)油包水微滴，在普通PCR儀上擴(kuò)增，最后通過(guò)微滴讀取儀讀取每一個(gè)微滴的熒光信號(hào)。操作較為復(fù)雜，污染風(fēng)險(xiǎn)中。
2.新羿?TD1?微滴式數(shù)字PCR
新羿?TD1是一個(gè)國(guó)產(chǎn)的數(shù)字PCR平臺(tái)，基本的檢測(cè)流程：通過(guò)微滴生成儀生成30000-50000個(gè)油包水微滴，在普通PCR儀上擴(kuò)增，最后通過(guò)微滴讀取儀讀取每一個(gè)微滴的熒光信號(hào)。該平臺(tái)的微滴生成和讀取都在專(zhuān)用的芯片中進(jìn)行，污染的風(fēng)險(xiǎn)低。
4.ThermoFisher QuantStudio?3D?芯片式數(shù)字PCR
?ThermoFisher QuantStudio 3D是另一個(gè)經(jīng)典的芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)，其基本的檢測(cè)流程是：將反應(yīng)液加入到涂布器中，通過(guò)涂布器將反應(yīng)液均勻涂布在有20000個(gè)微孔的芯片上，將芯片放在PCR儀上擴(kuò)增，最后將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號(hào)。操作較為復(fù)雜，整個(gè)過(guò)程在封閉的芯片中進(jìn)行，污染的風(fēng)險(xiǎn)較低。
5.JN MEDSYS Clarity芯片式數(shù)字PCR
JN MEDSYS Clarity是一個(gè)較新的芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)，其基本的檢測(cè)流程是：將反應(yīng)液加入到涂布器中，通過(guò)涂布器將反應(yīng)液均勻涂布在固定在PCR管中有10000個(gè)微孔的芯片上，反應(yīng)液通過(guò)毛細(xì)管作用進(jìn)入芯片，將帶有芯片的PCR管放在PCR儀上擴(kuò)增，最后將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號(hào)。操作較為復(fù)雜。污染的風(fēng)險(xiǎn)較低。
