新型冠狀病毒（2019-nCoV）特異IgM和IgG抗體檢測(cè)寫進(jìn)了國(guó)家衛(wèi)生健康委于2020年3月3日發(fā)布的“新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）“，作為臨床確診標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）也應(yīng)急審批了廣州萬孚（膠體金試紙條）、英諾特（唐山）（膠體金試劑條）、博奧賽斯（重慶）（化學(xué)發(fā)光免疫法）和廈門萬泰凱瑞（化學(xué)發(fā)光免疫法）等四家企業(yè)的五個(gè)抗體檢測(cè)試劑盒；

其中廣州萬孚和廈門萬泰凱瑞檢測(cè)的是抗新型冠狀病毒總抗體，其他兩家檢測(cè)的是IgM和IgG抗體，臨床已開始廣泛應(yīng)用這些試劑對(duì)患者進(jìn)行檢測(cè)，其他一些正申請(qǐng)審批的試劑如獲得CE認(rèn)證的深圳亞輝龍的IgM和IgG抗體試劑（化學(xué)發(fā)光免疫法）也在臨床大量應(yīng)用。

徐萬洲等在19例核酸檢測(cè)陰性但基于臨床癥狀確診的 COVID-19 患者中：

• 有 16 例患者 2019-nCoV IgM 陽性，其陽性率達(dá)到 84.21%；

• 有 18 例患者 2019-nCoV IgG 陽性，其陽性率達(dá)到 94.74%；

  
  

說明抗體的檢測(cè)可以有效地彌補(bǔ)核酸檢測(cè)漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)揮其在新型冠狀肺炎（COVID-19）的及時(shí)診治及防控中的作用。

但臨床現(xiàn)也有反映出現(xiàn)了較多的假陽性，困擾臨床決策。

2019-nCoV特異IgM和IgG抗體檢測(cè)出現(xiàn)假陽性的原因是什么？如何最大程度的識(shí)別假陽性并避免假陽性對(duì)臨床的誤導(dǎo)？以及在臨床應(yīng)用中，究竟要如何去用才能最有效地發(fā)揮其對(duì)2019-nCoV感染的診斷和防控價(jià)值？是一個(gè)必須要直接面對(duì)并且無法回避的問題。

一、?2019-nCoV特異IgM和IgG抗體的診斷意義

從機(jī)體對(duì)病原體的體液免疫應(yīng)答來看，病原體的特定蛋白如2019-nCoV的S蛋白和N蛋白等會(huì)刺激免疫系統(tǒng)引起抗體應(yīng)答，最早出現(xiàn)的抗體是IgM及其后的IgA抗體，然后是IgG抗體，從急性感染的一般過程，當(dāng)IgG抗體出現(xiàn)后，濃度會(huì)持續(xù)增高，IgM則持續(xù)降低，直至消失，IgG抗體會(huì)較長(zhǎng)時(shí)間存在。

因此，特異IgM和IgG抗體是一對(duì)出現(xiàn)有序，此消彼長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)系。所以我們?cè)岢?，正確地利用及觀察IgM/IgG的動(dòng)態(tài)變化（如圖1），有助于在病毒核酸檢測(cè)這個(gè)臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”失效后（因病程、標(biāo)本采集等所致的假陰性）的2019-nCoV感染的診斷。

?那為什么一定要是動(dòng)態(tài)的，而不能是靜態(tài)的檢測(cè)一次呢？這是由免疫檢測(cè)的特性所決定的，也就是抗體檢測(cè)會(huì)因?yàn)榕R床標(biāo)本中的一些干擾物質(zhì)的存在而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

也許有同道要問，那為什么我們檢測(cè)乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人類免疫缺陷病毒（HIV）等則可以靜態(tài)只檢測(cè)一次呢？其實(shí)也不是一次，這些病毒感染主要為慢性感染，無法如上述急性感染那樣去動(dòng)態(tài)觀察確認(rèn)，只能是通過如下辦法確證：如HBV有多個(gè)標(biāo)志物（如“兩對(duì)半”），可相互確認(rèn)，出現(xiàn)罕見的單獨(dú)HBsAg陽性，則有中和實(shí)驗(yàn)確證；抗-HCV和抗-HIV陽性，也必須經(jīng)過確證實(shí)驗(yàn)如病毒核酸檢測(cè)或免疫印跡實(shí)驗(yàn)后，才能報(bào)出陽性結(jié)果。

圖1. IgM/IgG用于判斷急性或近期感染的動(dòng)態(tài)檢測(cè)及判斷方法

二、?IgM和IgG抗體檢測(cè)假陽性的原因以及如何最大程度的避免

特異IgM和IgG免疫測(cè)定假陽性通常有以下兩個(gè)方面的原因，一是試劑盒陽性判斷值（Cut-off value）的設(shè)定，一些處于陽性判斷值附近的弱陽性結(jié)果，很可能是假陽性；其二是患者標(biāo)本中存在導(dǎo)致免疫測(cè)定假陽性的內(nèi)源性或外源性干擾物質(zhì)。

（一）陽性判斷值的設(shè)定

膠體金試紙條檢測(cè)是通過肉眼觀察顏色有否來判斷陽性和陰性，不存在陽性判斷值的問題，但會(huì)存在不同檢測(cè)者判斷的差異。

化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)（CLIA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）則需要設(shè)定陽性判斷值，其較好的做法是通過測(cè)定大量的陰性人群（可數(shù)千份）和一定數(shù)量（可數(shù)百份）的已知陽性人群標(biāo)本，會(huì)得到如圖2的一個(gè)分布，采用接受機(jī)工作特性（Receiver Operating characteristic，ROC）曲線或其他統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的陽性判斷值，通常為假陽性和假陰性均較低且達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)的測(cè)定信號(hào)如OD值或發(fā)光值。因此，不可避免處于其周邊陽性一側(cè)的結(jié)果，會(huì)有一部分弱陽性其實(shí)際為假陽性。

圖2.?依據(jù)陰性和陽性人群檢測(cè)值的分布確定陽性判斷值

（二）干擾物質(zhì)

1、 內(nèi)源性? ：?內(nèi)源性干擾物質(zhì)一般包括類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補(bǔ)體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig 抗體等。在日常的臨床血清（漿）標(biāo)本中，有相當(dāng)比例的標(biāo)本不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì)，從而可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的假陽性。

（1）類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factors，RF）

在類風(fēng)濕患者、其他疾病以及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的RF，其通常為IgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)，因此在免疫測(cè)定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的標(biāo)記的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測(cè)定中表現(xiàn)最為明顯，因?yàn)榇藭r(shí)固相包被的抗體為抗人μ鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。

為避免RF的干擾，通常可采取以下措施：

• 稀釋標(biāo)本。這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體檢測(cè)等尤為有用。因?yàn)榧毙愿腥緯r(shí)，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高，而RF滴度通常相對(duì)要低很多。因此，在測(cè)定前對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，特異的IgM因高滴度仍可檢出，而非特異的RF則會(huì)因?yàn)橄♂屪兂珊艿偷牡味?，從而不影響測(cè)定。

  
  

• 改變酶標(biāo)抗體。由于RF結(jié)合的是IgG的Fc片段，如果將標(biāo)記抗體的Fc片段酶切去除，僅留下具有特異結(jié)合功能的F(ab’)2部分用于標(biāo)記，則在測(cè)定中即可避免RF的干擾。

  
  

• 標(biāo)本中RF用變性IgG預(yù)先封閉。將經(jīng)熱變性（63℃，10 min）的動(dòng)物如兔、羊等的IgG加入到標(biāo)本稀釋液中。此外，在測(cè)定特異IgM時(shí)，也可使用抗人IgG去除臨床標(biāo)本中RF和IgG。

  
  

• 測(cè)定時(shí)，可在標(biāo)本中加入一定濃度的尿素，其可以解離低親合力結(jié)合的RF和IgG，因而可以去除RF的干擾。

  
  

（2）嗜異性抗體（Heterophilicantibodies）?

人類血清中可能會(huì)含有抗嚙齒類動(dòng)物（如鼠、馬、羊等）的抗體，即天然嗜異性抗體。有研究表明，天然的嗜異性抗體（IgG）可分為兩類，一類（85%的假陽性由其引起）可結(jié)合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區(qū)域，但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結(jié)合于小鼠、馬、牛和兔IgG的FC區(qū)表位，但不與山羊和大鼠IgG的FC區(qū)表位結(jié)合。嗜異性抗體可通過交聯(lián)固相和標(biāo)記的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。

由嗜異性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：

• 使用特異的兔F(ab’)2片段作為固相或測(cè)定標(biāo)記抗體。

  
  

• 在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動(dòng)物Ig，封閉可能存在的嗜異性抗體。但加入量不足或亞類不同時(shí)無效。

（3）補(bǔ)體

在固相免疫測(cè)定中，來自哺乳動(dòng)物的固相特異抗體和標(biāo)記二抗均可以激活人補(bǔ)體系統(tǒng)。因?yàn)槠湓诠滔辔郊敖Y(jié)合過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)， Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，這樣C1q就成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

由補(bǔ)體引起的干擾可采用56℃30 min加熱可使標(biāo)本中的補(bǔ)體C1q滅活。但實(shí)施前，一定要有實(shí)驗(yàn)證明這種滅活不會(huì)影響特定試劑的檢測(cè)結(jié)果。

（4）因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig?抗體

在臨床上，有可能使用鼠源性單克隆抗體進(jìn)行靶向治療，及使用放射性核素標(biāo)記鼠源性單克隆抗體進(jìn)行影像診斷等，均有可能使相應(yīng)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體。這種抗鼠抗體對(duì)使用鼠源性單克隆抗體的免疫測(cè)定，可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免：

• 使用特異的抗體F(ab’)2片段作為固相或測(cè)定酶標(biāo)抗體。

  
  

• 在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。

（5）溶菌酶

溶菌酶可與等電點(diǎn)較低的蛋白有強(qiáng)的結(jié)合能力。免疫球蛋白等電點(diǎn)約為5，因此，在免疫測(cè)定中，溶菌酶可在包被的IgG和標(biāo)記的IgG間形成橋接，從而導(dǎo)致假陽性。Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其聯(lián)接IgG。

2. 外源性? ：外源性干擾物質(zhì)包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不全等。

（1）標(biāo)本溶血

要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白的血紅素基團(tuán)有類似過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記酶的ELISA和CLIA中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其在溫育過程中會(huì)吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色或發(fā)光，導(dǎo)致假陽性。

（2）標(biāo)本貯存時(shí)間過長(zhǎng)???

標(biāo)本在2~8℃下保存時(shí)間過長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法免疫測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性。

（3）標(biāo)本凝固不全 :

血液采集后，如收集管中無促凝劑和抗凝劑，則血液通常在半小時(shí)后開始凝固，18~24h完全凝固。

日常檢驗(yàn)中，有可能在血液還未開始凝固時(shí)即離心分離血清，此時(shí)因血液沒有完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，如將其加入微孔中，在ELISA測(cè)定過程中仍可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果。

因此，血液標(biāo)本采集后，應(yīng)使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?/span>

綜上所述，盡管從方法學(xué)設(shè)計(jì)及臨床應(yīng)用中，通過一些方法和措施可以大大減少IgM和IgG抗體檢測(cè)的假陽性，但無法完全避免。

如何才能最有效地發(fā)揮特異IgM和IgG抗體檢測(cè)對(duì)新冠病毒感染的診斷和防控價(jià)值

任何一個(gè)臨床檢測(cè)項(xiàng)目，都是為了特定患者人群在其疾病發(fā)生發(fā)展過程中某個(gè)特定時(shí)間的疾病的診斷或治療的，簡(jiǎn)單的講，就是要對(duì)正確的患者（who）在正確的時(shí)間（when）開出正確的檢驗(yàn)申請(qǐng)單（what）。

那么，2019-nCoV特異的IgM和IgG抗體只能是用于在臨床疑似COVID-19且病毒核酸檢測(cè)陰性時(shí)，為明確診斷，可按照?qǐng)D1所示動(dòng)態(tài)多次（2次以上）檢測(cè)患者，通過動(dòng)態(tài)變化來判IgM和IgG檢測(cè)陽性的真假，從而避免假陽性結(jié)果對(duì)臨床診斷的誤導(dǎo)。

當(dāng)然，對(duì)于臨床疑似患者，特異IgM和IgG抗體的檢測(cè)也可與病毒核酸檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，當(dāng)核酸檢測(cè)為陰性時(shí)，抗體檢測(cè)出現(xiàn)圖1中的四種模式的任何之一，不管后續(xù)的核酸檢測(cè)是否陽性，只要是真正的病毒感染者，應(yīng)基本上都可以通過后續(xù)的抗體動(dòng)態(tài)檢測(cè)出現(xiàn)的結(jié)果模式明確診斷。

此外，針對(duì)2019-nCoV刺突（S）蛋白的抗體具中和病毒的作用，采用S蛋白作為抗原的檢測(cè)到的IgG抗體的出現(xiàn)并持續(xù)升高，應(yīng)具有很好的預(yù)后及康復(fù)指示價(jià)值。

要注意的是，現(xiàn)在出現(xiàn)了將特異抗體的檢測(cè)大規(guī)模用于復(fù)工或一般人群篩查的現(xiàn)象，是不可以的，其原因就是因?yàn)樯鲜黾訇栃缘某霈F(xiàn)是無法完全避免的。一般人群篩查，一旦出現(xiàn)陽性，會(huì)造成大量人群需要的隔離，帶來混亂。

并且，抗體檢測(cè)陰性，也不能排除2019-nCoV的感染。所以這種篩查的成本效益極低。NMPA在已批準(zhǔn)的2019-nCoV的特異抗體試劑盒說明書中的預(yù)期用途中都明確寫出：僅用作對(duì)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測(cè)指標(biāo)或疑似病例診斷中與核酸檢測(cè)協(xié)同使用，不能作為新型冠狀病毒感染的肺炎確診和排除的依據(jù)，不適用于一般人群的篩查。

綜上所述，COVID-19特異IgM/IgG抗體完全可以作為COVID-19在病毒核酸檢測(cè)陰性情況下的確診標(biāo)準(zhǔn)，其前提是需要2次以上的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，以避免因標(biāo)本中RF等免疫測(cè)定干擾物質(zhì)的存在所致的假陽性結(jié)果的誤導(dǎo)。正因?yàn)橛羞@種假陽性的存在，特異IgM/IgG抗體檢測(cè)不適用復(fù)工等一般人群的篩查，這是必須要強(qiáng)調(diào)的。