醫(yī)械創(chuàng)新資訊
PD-L1抗體試劑的審評挑戰(zhàn)
免疫治療自2013年被評為“突破性療法”以來，美國、歐洲、日本等國家已批準(zhǔn)了多個用于不同癌種的PD-1/PD-L1免疫藥物，我國也于近期批準(zhǔn)上市了PD-1免疫藥物。隨著PD-1/PD-L1免疫藥物的廣泛使用，如何應(yīng)用免疫標(biāo)志物選擇合適的治療人群成為免疫治療面臨的主要挑戰(zhàn)之一。
多項大型臨床研究顯示，在腫瘤患者中，PD-1/PD-L1抑制劑治療的獲益程度與腫瘤患者PD-L1表達存在相關(guān)性。通過免疫組織化學(xué)的方法檢測腫瘤患者的PD-L1表達是目前公認的最為有效的方法。對腫瘤患者的PD-L1表達水平進行檢測，可以鑒別出哪些腫瘤患者適合使用PD-1/PD-L1抑制劑進行治療。
目前世界各國針對PD-1/PD-L1抑制劑開發(fā)了多個基于免疫組織化學(xué)方法的檢測試劑，用于評估PD-L1的表達情況，包含不同的抗體、克隆、平臺、評分系統(tǒng)和臨界值設(shè)定，分別作為各自藥物的伴隨診斷試劑。但4種PD-1/PD-L1抑制劑臨床研究中應(yīng)用的檢測抗體（克隆號分別為28-8、22C3、SP142、SP263）均未在我國獲得上市批準(zhǔn)。目前，克隆號為SP263、SP142和22C3的抗體試劑在我國已進入注冊申請過程，其中部分申報產(chǎn)品進入優(yōu)先審查程序。
PD-L1抗體試劑的審評難點集中在臨床試驗部分。首先，PD-L1抗體試劑的判讀方式與一般輔助診斷用途的免疫組織化學(xué)抗體試劑有所不同。PD-L1的表達情況是通過計算任何染色強度下腫瘤細胞和/或免疫細胞染色的百分比予以評定。然而，不同克隆的PD-L1表達判讀標(biāo)準(zhǔn)以及閾值設(shè)定并不相同，陽性染色位置設(shè)定亦不相同，造成了PD-1/PD-L1抑制劑研究結(jié)果無法互相通用或橫向比較。如何選擇一致性研究中的對比試劑及合理進行平行判讀結(jié)果的比較，是審評過程中需要考慮的問題。
另外，目前國內(nèi)多家單中心初步研究數(shù)據(jù)顯示，我國肺癌患者的PD-L1表達與國外研究稍有不同，不同病理類型癌種的PD-L1表達情況與國外存在差異。因此，在伴隨診斷臨床意義的驗證中，如何合理接受境外臨床試驗數(shù)據(jù)也是審評過程中的挑戰(zhàn)。
關(guān)于人類Brca1/2基因突變檢測試劑注冊審評概述
一、Brca1基因和Brca2基因概述
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Brca1基因和Brca2基因都是常染色體顯性遺傳的腫瘤抑制基因，參與DNA的損傷修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明，Brca1/2基因突變的腫瘤細胞對PARP抑制劑的敏感性顯著高于正常細胞，通過抑制PARP-1的活性可使Brca1/2基因突變的腫瘤細胞發(fā)生合成致死。修飾酶PARP-1（Ⅰ型多聚ADP-核糖聚合酶，poly(ADP-ribose) polymerase 1）在DNA損傷修復(fù)和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，Brca1基因和Brca2基因發(fā)生突變的腫瘤細胞往往依賴PARP-1完成對DNA損傷的修復(fù)，因此PARP抑制劑通過抑制PARP-1的功能可靶向殺傷Brca1/2基因突變的腫瘤細胞。臨床研究表明，Brca1基因或Brca2基因突變的卵巢癌和乳腺癌患者可以從PARP抑制劑奧拉帕尼和Rubraca等治療中獲益。
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目前美國食品與藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）等已批準(zhǔn)PARP抑制劑用于治療Brca1基因或Brca2基因突變的卵巢癌患者。奧拉帕尼治療乳腺癌的臨床Ⅲ期研究于2017年宣布成功結(jié)束，達到臨床設(shè)計的首要終點目標(biāo)，結(jié)果顯示可顯著延長患者無進展生存期，2018年12月美國FDA批準(zhǔn)奧拉帕尼用于攜帶Brca突變陽性的晚期卵巢癌患者一線含鉑化療完全或部分緩解患者的維持治療。該藥已于2018年8月在中國批準(zhǔn)上市。
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二、Brca1基因和Brca2基因檢測試劑及審評難點
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美國FDA陸續(xù)批準(zhǔn)了Brca1/2突變基因檢測產(chǎn)品上市。該類產(chǎn)品其共同特點是由美國FDA指定該類產(chǎn)品在單一檢測地點進行檢測。而目前國內(nèi)部分專家并不完全認同該模式，認為國內(nèi)臨床機構(gòu)的檢測和判讀能力不低于企業(yè)的檢測和判讀能力，且中美醫(yī)療環(huán)境及該類產(chǎn)品實際臨床檢測應(yīng)用發(fā)展存在差異。部分臨床機構(gòu)配備相關(guān)人員，具有較強的檢測和解讀能力，但因Brca檢測業(yè)務(wù)在中國開展較晚，只少數(shù)醫(yī)院能夠滿足上述條件。部分臨床機構(gòu)目前不具備相關(guān)檢測能力和/或解讀能力，質(zhì)量難以評價和控制。
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開展基于NGS測序原理的Brca檢測需要配備NGS實驗室及相關(guān)試驗人員及生物信息解讀人員等，目前歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟(European Molecular Genetics Quality Network,EMQN)和國家衛(wèi)生和計劃生育委員會病理質(zhì)控評價中心(PQCC)會對Brca每年進行室間質(zhì)評，國內(nèi)部分檢驗機構(gòu)也進行過Brca項目的室間質(zhì)評。但目前對于NGS實驗室還沒有有效的體系規(guī)范和考核，對解讀人員資質(zhì)的認可也缺乏有效手段。
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國內(nèi)目前沒有公認的人類遺傳病數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)對比主要依靠國外數(shù)據(jù)。如何讓申請人的軟件接入的數(shù)據(jù)庫充分且合理，以及如果國內(nèi)出現(xiàn)數(shù)據(jù)庫，什么樣的數(shù)據(jù)庫是可接受的等問題，都是需要進一步探索的問題。
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三、小結(jié)
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通過前期調(diào)研和討論，我部門認為該類產(chǎn)品的檢測應(yīng)用機構(gòu)能力非常重要、檢測結(jié)果解讀較為復(fù)雜，以及目前中國人群遺傳信息數(shù)據(jù)缺乏等問題，需要在其申請上市時對應(yīng)用檢測地點、產(chǎn)品質(zhì)量、結(jié)果解讀、產(chǎn)品監(jiān)管等方面加強考慮。?
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考慮到該類產(chǎn)品有重要的臨床意義，為了保障檢測質(zhì)量和結(jié)果解讀的能力。在技術(shù)審評過程中，我們將考慮結(jié)合產(chǎn)品將其應(yīng)用范圍限制在一定檢測范圍內(nèi)。如申請人相關(guān)的檢測中心及一定范圍內(nèi)的臨床機構(gòu)。
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Brca檢測應(yīng)用中，Brca遺傳信息數(shù)據(jù)庫是結(jié)果判斷的重要依據(jù)。理想的遺傳性疾病數(shù)據(jù)庫應(yīng)該做到公開、可溯源、不可篡改數(shù)據(jù)、符合倫理要求、有專人或團隊負責(zé)數(shù)據(jù)的更新和維護等。鼓勵國內(nèi)大的遺傳數(shù)據(jù)庫按照上述原則進行建設(shè)，并逐步建立國內(nèi)中國人群數(shù)據(jù)庫。
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綜上，我們將積極探索我國該類產(chǎn)品的審評模式和上市相關(guān)問題。
水通道蛋白抗體檢測試劑注冊審評概述
水通道蛋白抗體（AQP4-IgG）檢測對于視神經(jīng)脊髓炎（NMO）診斷具有顯著臨床意義。目前我國尚無該類試劑上市，此種情況給臨床NMO診斷帶來了一定的困難。《關(guān)于深化審評審批制度改革鼓勵藥品醫(yī)療器械創(chuàng)新的意見》明確提出：“支持罕見病治療藥品醫(yī)療器械研發(fā)，對境外已批準(zhǔn)上市的罕見病治療藥品醫(yī)療器械，可附帶條件批準(zhǔn)上市。”為了支持和鼓勵相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《用于罕見病防治醫(yī)療器械注冊審查指導(dǎo)原則》。作為技術(shù)審評機構(gòu)，在相關(guān)產(chǎn)品審評過程中，會依據(jù)法規(guī)政策和技術(shù)文件，結(jié)合該類產(chǎn)品的特點，科學(xué)審評，優(yōu)先審評，促進該類產(chǎn)品盡快用于臨床，使罕見病患者受益。
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視神經(jīng)脊髓炎（NMO）是一種以視神經(jīng)和脊髓受累為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，是目前公認的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。NMO臨床上多以嚴重的視神經(jīng)炎和縱向延伸的長節(jié)段橫貫性脊髓炎為特征表現(xiàn)，常于青壯年起病，女性居多，復(fù)發(fā)率及致殘率高，可導(dǎo)致失明和癱瘓。NMO是一種罕見病，其在非白種（亞洲、拉丁美洲、非洲、西班牙裔和美國原住民）人群中更為易感，目前已列入我國《第一批罕見病目錄》。
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AQP4-IgG是視神經(jīng)脊髓炎的特異性標(biāo)記物，作為診斷指標(biāo)被列入相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)和國內(nèi)的《中國視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病診斷與治療指南》。其中明確，以AQP4-IgG進行診斷分層，可將NMO分為AQP4-IgG陽性組與陰性組。對于AQP4-IgG陽性組，僅需一項核心臨床特征，并且排除其他診斷即可確診；對于AQP4-IgG陰性組，則需要更多且更加嚴格的附加條件才可確診。
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多發(fā)性硬化癥（MS）是另一種炎性脫髓鞘病，與NMO的臨床表現(xiàn)相似，在診斷時易與NMO混淆。NMO主要應(yīng)用免疫抑制劑治療，而MS以免疫調(diào)節(jié)治療為主，所以誤診會給患者造成較大危害。AQP4-IgG可以對MS與NMO進行鑒別診斷，提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。
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一、AQP4-IgG檢測試劑上市批準(zhǔn)情況
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英國RSR公司的AQP4-IgG檢測試劑先在歐洲上市，RSR公司又通過合作商KRONUS, Inc.使其產(chǎn)品在美國上市。另外，Cosmic Corporation采用RSR公司原材料生產(chǎn)的試劑在日本上市，德國歐蒙公司的AQP4-IgG間接免疫熒光檢測試劑盒（IIFT）在歐洲上市。由于我國尚無AQP4-IgG檢測試劑上市，在臨床實際中，部分患者很難確診，只能給予脫髓鞘病這一寬泛的臨床診斷，甚至有部分患者被誤診為MS，導(dǎo)致接受錯誤的治療。2018年，RSR公司向國家藥品監(jiān)管局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心提交了水通道蛋白抗體（AQP4 Ab）測定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）的注冊申請。作為診斷罕見病且具有明顯臨床優(yōu)勢的產(chǎn)品，該產(chǎn)品已進入優(yōu)先審批程序。
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二、AQP4-IgG檢測試劑的審評思路
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（一）臨床試驗
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作為國內(nèi)同品種首個產(chǎn)品，因無國內(nèi)已上市同類試劑，AQP4-IgG檢測試劑的臨床試驗無法與已上市試劑進行比較研究，因此，須通過使用國外已上市產(chǎn)品作為實驗室檢測方法進行比對，同時結(jié)合疾病診斷的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進行綜合評價，以確定其臨床靈敏度和特異度。
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由于存在AQP4-IgG陰性的NMO，所以該指標(biāo)靈敏度存在不足。但作為NMO特有的生物免疫標(biāo)志物，AQP4-IgG具有高度特異性，相關(guān)指南也對其特異性進行了強調(diào)。如果特異性差，出現(xiàn)假陽性，則極易造成誤診。本產(chǎn)品采用酶聯(lián)免疫法，相對較敏感，容易出現(xiàn)假陽性，所以在臨床試驗中，應(yīng)入組NMO病例及非NMO病例，非NMO病例應(yīng)包括臨床診斷為MS、其他脫髓鞘病和其他自身免疫病的病例，重點關(guān)注其特異度結(jié)果。臨床試驗病例數(shù)估算采用診斷試驗樣本量的估算模型，根據(jù)產(chǎn)品臨床應(yīng)用預(yù)期的靈敏度及置信區(qū)間估算陽性病例數(shù)量，根據(jù)產(chǎn)品臨床應(yīng)用的特異度及置信區(qū)間估算陰性病例數(shù)量。臨床試驗評價指標(biāo)為置信區(qū)間的寬度是否滿足期望值。
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由于NMO陽性病例難以收集，如果產(chǎn)品臨床研究中陽性例數(shù)不滿足統(tǒng)計學(xué)要求，但在已有試驗數(shù)據(jù)可在一定程度上提示產(chǎn)品的靈敏度及置信區(qū)間滿足臨床應(yīng)用的前提下，可認同其臨床試驗。同時依據(jù)《用于罕見病防治醫(yī)療器械注冊審查指導(dǎo)原則》，附帶條件批準(zhǔn)產(chǎn)品上市，要求注冊人繼續(xù)總結(jié)產(chǎn)品臨床應(yīng)用情況，并對產(chǎn)品進行上市后評價。
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（二）陽性判斷值研究
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由于該產(chǎn)品具有明顯的輔助診斷價值，其陽性判斷值研究資料至關(guān)重要，因此應(yīng)采用來源于NMO患者、MS患者、其他脫髓鞘病和其他自身免疫病患者及健康人群的真實樣本，對陽性判斷值進行充分研究，建議采用受試者工作特征曲線（ROC）的分析方法，研究確定陽性判斷值。
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（三）定性或定量的考量
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由于AQP4-IgG沒有公認的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，需通過稀釋檢測多例陽性樣本，對一定吸光度值的樣本賦予量值，從而建立穩(wěn)定的企業(yè)參考品和溯源體系，這種溯源方法屬于相對定量。在日本和歐盟上市的AQP4-IgG檢測試劑為定量檢測，在美國上市的AQP4-IgG檢測試劑為半定量。目前臨床使用中，對于AQP4-IgG濃度的高低是否具有臨床意義存在爭論，部分觀點認為監(jiān)測AQP4-IgG的濃度對疾病進展和復(fù)發(fā)預(yù)測具有一定的應(yīng)用價值，但是由于罕見病例數(shù)、試劑的可獲得性欠缺等諸多因素，這一觀點尚未經(jīng)過充分證實。
包蟲病臨床診斷及病原體相關(guān)游離DNA（cfDNA）簡介
一、包蟲病簡介
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包蟲病又名棘球蚴病，是一種古老的人畜共患性寄生蟲病，主要由人感染棘球絳蟲的幼蟲所致。該疾病分為囊型包蟲病和泡型包蟲病兩種，分別由細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染引起。兩種絳蟲都必須在哺乳類動物體內(nèi)寄生才能完成生活史，細粒棘球絳蟲的終末宿主一般為犬和狼；多房棘球絳蟲的終末宿主一般為狐貍、犬和狼。
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近年來，包蟲病呈全球性分布，我國包蟲病主要流行于西北牧區(qū)和半農(nóng)半牧地區(qū)，其中以新疆、西藏、寧夏、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、四川7省最為嚴重。根據(jù)文獻報道，我國西部人群包蟲病的感染率為3.1%～ 31.5%，患病率為0.5%～5.0%，其中青藏高原部分地區(qū)人群患病率為5.0％～10.0％。據(jù)2010年原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會“防治包蟲病行動計劃(2010—2015)”，我國西部地區(qū)包蟲病平均患病率為1.08％，受威脅人口約為6600萬，每年造成直接經(jīng)濟損失30億元。
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二、包蟲病診斷依據(jù)
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根據(jù)現(xiàn)行包蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)，包蟲病的臨床診斷要綜合考慮：流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、實驗室檢查及病原學(xué)檢查幾個方面。
1.流行病學(xué)史
該部分主要考慮患者是否有在流行區(qū)的居住、工作、旅游或狩獵史，或與犬、牛、羊等家養(yǎng)動物或狐、狼等野生動物及其皮毛的接觸史；在非流行區(qū)有從事來自流行區(qū)的家畜運輸、宰殺、畜產(chǎn)品及皮毛加工等暴露史。
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2.臨床表現(xiàn)
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患者主要的臨床表現(xiàn)為棘球蚴的囊占位所致的壓迫、刺激、囊破裂引起的一系列癥狀，囊性包蟲病可發(fā)病全身多個器官，以肝、肺為常見；泡型包蟲病原發(fā)病灶幾乎都位于肝臟。
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3.影像學(xué)檢查
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主要為通過B超掃描、X線檢查、計算機斷層掃描或磁共振檢查發(fā)現(xiàn)占位性病變。
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4.實驗室檢查
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通過酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接紅細胞吸附試驗、PVC膜快速ELISA、免疫印跡技術(shù)等方法對包蟲病相關(guān)的特異性抗體、循環(huán)抗原、免疫復(fù)合物進行檢測。
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5.病原學(xué)檢查
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在手術(shù)活檢材料、切除的病灶或排出物中發(fā)現(xiàn)棘球蚴的囊壁、子囊、原頭節(jié)或頭鉤。此為包蟲病的確診方法。
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三、相關(guān)檢測產(chǎn)品介紹
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對來源于患者或疑似患者人體樣本中的包蟲病感染相關(guān)生物標(biāo)志物進行檢測是輔助診斷包蟲病的重要手段。相關(guān)生物標(biāo)志物包括特異性抗體、循環(huán)抗原、免疫復(fù)合物、病原體核酸等。我國已批準(zhǔn)四個包蟲病抗體檢測試劑，產(chǎn)品信息見表1，已批準(zhǔn)產(chǎn)品均采用免疫學(xué)方法對樣本中的病原體抗體進行檢測，免疫學(xué)檢測有其自身的局限性，一方面，由于細粒棘球蚴和多房棘球蚴兩種病原體自身抗原存在交叉的特點，導(dǎo)致應(yīng)用抗體檢測來區(qū)分囊型/泡型效果欠佳；另一方面，抗體檢測無法區(qū)分現(xiàn)癥感染與既往感染。隨著檢測技術(shù)的進步，病原體核酸及其游離DNA（cfDNA）檢測為感染的輔助診斷提供新的思路。目前，國際上尚無包蟲病核酸檢測相關(guān)的產(chǎn)品，我國已有細粒棘球蚴和多房棘球蚴核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）產(chǎn)品獲批進入國家藥監(jiān)局創(chuàng)新醫(yī)療器械特別審查程序，該產(chǎn)品臨床應(yīng)用的安全有效性仍然在驗證過程中。
表1 我國已批準(zhǔn)的包蟲病檢測試劑
四、病原體相關(guān)游離DNA（cfDNA）簡介
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近年來，隨著對寄生蟲血漿游離DNA（cfDNA）的研究，cfDNA在寄生蟲病的檢測中得到了快速發(fā)展，目前已有應(yīng)用cfDNA檢測對瘧原蟲、弓形蟲、利士曼原蟲、錐蟲、血吸蟲等寄生蟲感染進行輔助診斷的報道。針對寄生蟲感染后cfDNA的來源，可能是蟲體或蟲卵的細胞或碎片在增生、成熟、脫落、腐爛、崩解等過程中主動分泌或被動釋放出內(nèi)部的DNA進入宿主體液循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生；也有研究表明絳蟲主動分泌的外泌體是寄生蟲感染后患者體內(nèi)出現(xiàn)蟲源DNA的重要原因。基于上述研究，檢測樣本中細粒棘球蚴和多房棘球蚴兩種病原體游離DNA為該疾病的輔助診斷提供了理論基礎(chǔ)。
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五、檢測游離DNA的考量
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寄生蟲源cfDNA的檢測在臨床應(yīng)用中存在一定優(yōu)勢，一方面，可根據(jù)特異性的基因序列對兩種不同種類的病原體進行分型，從而達到對疾病進行分型的目的；另一方面，患者樣本中存在寄生蟲DNA在一定程度上可提示患者可能感染相關(guān)病原體。然而，作為一個新的標(biāo)志物，能夠應(yīng)用于臨床，在現(xiàn)有的理論基礎(chǔ)上，還應(yīng)進一步研究。一是，應(yīng)進一步明確患者不同疾病進展階段血漿游離DNA濃度的變化，并以此為基礎(chǔ)，確定該標(biāo)志的臨床預(yù)期用途（如：疾病早篩、輔助診斷、鑒別診斷及治療監(jiān)測等）；二是，應(yīng)依據(jù)標(biāo)志物擬定的預(yù)期用途，進一步對該標(biāo)志物進行臨床驗證，臨床研究應(yīng)考慮入組人群、對照方法等，如該標(biāo)志用于疾病的鑒別診斷，則入組人群應(yīng)為包蟲病疑似人群，其中不同大小占位性病變病例、不同病灶退變（CE4、CE5）病例、不同基因型病例等均應(yīng)入組，此外還應(yīng)考慮非包蟲病病例的干擾。用于疾病鑒別診斷用途的臨床研究其對照方法應(yīng)為疾病確診的標(biāo)準(zhǔn)即病原學(xué)檢查。
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六、總結(jié)
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我國包蟲病防控形勢嚴峻，包蟲病流行區(qū)多為相對偏遠、落后的地區(qū)，目前包蟲病的診斷很大程度上依賴于影像學(xué)和病原學(xué)，這不僅對臨床醫(yī)生專業(yè)技術(shù)水平要求較高，還存在一定程度的誤診、漏診的風(fēng)險。血漿游離cfDNA檢測操作較為簡便，結(jié)果易于解讀，如能按預(yù)期應(yīng)用于臨床，將對包蟲病的診斷起到積極作用。
乙型肝炎病毒耐藥基因檢測概述
一、乙型肝炎病毒耐藥基因檢測的臨床意義
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WHO相關(guān)資料顯示，全球感染過乙型肝炎病毒（HBV）的患者超過三分之一，而慢性乙型肝炎患者約有2.4億，乙肝嚴重影響著人類的生命健康。HBV是傳染性疾病乙型病毒性肝炎的主要病因，感染HBV可引起肝硬化甚至肝細胞癌變。HBV屬嗜肝DNA病毒科，為雙鏈DNA病毒，容易發(fā)生變異，從而形成不同的基因型。目前已根據(jù)HBV核苷酸序列異質(zhì)性≥8%將其分成A-J 10種基因型。在我國北方以C型為主，南方以B型為主，新疆有出現(xiàn)D型。作為常規(guī)抗病毒治療的核苷（酸）類似藥物，拉米夫定(LAM)和阿德福韋酯(ADV)等能夠有效抑制HBV的復(fù)制，然而長期使用會導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，使治療效果明顯下降。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)用于HBV的基因分析，從而為乙肝患者的抗病毒治療提供科學(xué)的依據(jù)。盡早檢測HBV變異，準(zhǔn)確判斷拉米夫定和阿德福韋酯等治療后耐藥，指導(dǎo)個性化用藥，對于提高乙肝治療成功率具有很重要的價值。
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二、乙型肝炎病毒耐藥機制以及常見的突變基因位點
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HBV基因型耐藥是指乙肝病毒出現(xiàn)某種特定的突變，這些特定的突變點導(dǎo)致HBV耐藥。其分子機制是：HBV是一種變異較高的病毒，在復(fù)制過程必須經(jīng)過RNA中間體的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制步驟，但RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，因此在宿主免疫壓力和抗病毒藥物的選擇壓力下，其核酸在少數(shù)位點上發(fā)生突變是一種常見現(xiàn)象。
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HBV對核苷（酸）類似物耐藥的產(chǎn)生與HBV聚合酶基因變異有關(guān)，并且HBV聚合酶基因變異是多位點的，以C區(qū)YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）基序的變異最為重要。拉米夫定(LAM)的主要耐藥位點位于C區(qū)（rtM204V/I），204位點的蛋氨酸被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）置換，即rtM204V/I。上述突變直接導(dǎo)致病毒對藥物的敏感性降低，被稱為原發(fā)耐藥突變。另外部分突變不直接引起病毒對藥物敏感性的下降，但可以恢復(fù)原發(fā)耐藥變異病毒受損的復(fù)制力，被稱為補償耐藥突變，主要有rtV173L、rtL180M(常與rtM204V共同出現(xiàn))和rtL80I(常與rtM204I共同出現(xiàn))。比如，HBV雙點突變株如rtM204V/rtL180M，其病毒復(fù)制能力強于rtM204I的單點突變株，可能與rtL180M（B區(qū)）的變異補償C區(qū)YMDD變異株的復(fù)制缺陷有關(guān)。而另一種代表藥物阿德福韋酯(ADV)，其耐藥變異位點則主要集中于HBV聚合酶基因B區(qū)rtA181T和D區(qū)rtN236T位點。
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三、乙型肝炎病毒耐藥基因檢測方法
1.PCR產(chǎn)物直接測序：是將HBV基因組的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)進行擴增后直接進行測序分析的方法。PCR產(chǎn)物直接測序法可檢測已知和可能的未知耐藥變異位點，是最常用的基因型耐藥檢測方法之一。PCR產(chǎn)物直接測序的方法一般作為基因型耐藥檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法的缺點是靈敏性較差，只有當(dāng)變異株超過HBV準(zhǔn)種池的20%時才能被發(fā)現(xiàn)。
2.聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)：該方法具有較強的靈敏性，可檢測數(shù)量占HBV準(zhǔn)種池5%的耐藥變異株。但是PCR-RFLP只能檢測已知、單一位點的變異，對于少數(shù)耐藥變異位點監(jiān)測不失為一種簡便、快速且廉價的方法。但隨著多種核苷（酸）類似物的相繼問世和HBV耐藥變異位點的不斷出現(xiàn)，該方法將難以勝任多位點變異的檢測。
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3.反向雜交法：基于該技術(shù)的INNO-LiPA方法在國外已獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床檢測，目前INNO-LiPA HBV DR v3 可檢測包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)與阿德福韋酯(ADV)常見耐藥位點。該法可檢測變異株占HBV準(zhǔn)種池5% ~ 10%的樣品，故敏感性較好，但其同樣只能檢測已知位點變異。
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4.實時熒光PCR：該方法操作簡便，可檢測變異發(fā)生率低于10%的耐藥變異。僅能檢測已知位點。
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5.基因芯片：亦稱DNA芯片、DNA微陣列，可檢測已知變異位點。
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6.限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)：該技術(shù)是將PCR-RFLP技術(shù)與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，靈敏度高，能夠發(fā)現(xiàn)數(shù)量不足HBV準(zhǔn)種池1%的變異株，但其同樣僅能檢測已知位點變異，且價格昂貴，很難在臨床推廣應(yīng)用。
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四、目前已上市產(chǎn)品介紹
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我國已批準(zhǔn)上市的乙型肝炎病毒耐藥基因檢測試劑盒較多采用熒光PCR法，主要為國產(chǎn)產(chǎn)品，針對的基因突變位點主要是204位點的YMDD→YIDD（550ATG→ATT及550ATG→ATC）與YMDD→YVDD（550ATG→GTG）。還有較少產(chǎn)品能夠檢測發(fā)生在180位點（rtL180M）的基因突變。
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五、小結(jié)
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由于肝細胞中的共價環(huán)狀閉合DNA持續(xù)存在，使得乙肝患者需要長期用藥治療。抗HBV核苷（酸）類藥物主要有拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)、阿德福韋酯(ADV)和富馬酸替諾福韋酯(TDF)，其中前4種已在我國上市。長期使用核苷（酸）類似藥物不可避免地導(dǎo)致耐藥基因突變，最終病毒恢復(fù)復(fù)制能力，病情反彈。盡早進行乙肝病毒耐藥基因突變的檢測，可以及時發(fā)現(xiàn)病毒的耐藥情況，指導(dǎo)醫(yī)生合理用藥。隨著生物檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的突變位點被發(fā)現(xiàn)，為此類產(chǎn)品的技術(shù)審評帶來挑戰(zhàn)。
體外診斷試劑與適用儀器的技術(shù)審評情況介紹
一、背景介紹
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《體外診斷試劑注冊管理辦法》規(guī)定,對于已獲批的試劑增加適用儀器情況，注冊人可以采取申請體外診斷試劑產(chǎn)品許可事項變更的形式進行注冊申報。區(qū)別于注冊申請，對于上述適用于變更的情況，注冊人可以在不改變產(chǎn)品的設(shè)計以及技術(shù)原理的情況下，進行設(shè)計變更的驗證或確認，更加靈活地進行產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)。
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二、我國的技術(shù)審評情況及發(fā)展趨勢
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隨著已獲批體外診斷試劑增加適用儀器的現(xiàn)象層出不窮, 本著科學(xué)審評的原則，參考國際先進監(jiān)管經(jīng)驗，我們也在工作過程中探索新的審評方式。具體的實施路徑是由注冊人具體變更情形，從技術(shù)分析和風(fēng)險管理兩個角度分析并說明變化部分對產(chǎn)品安全性、有效性可能產(chǎn)生的影響。根據(jù)上述分析和考量，自行選擇驗證或者確認變化部分對產(chǎn)品安全性、有效性影響的研究方法，包括分析性能以及臨床性能研究部分，并制定研究方法的選擇依據(jù)以及研究結(jié)果的驗收標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上制定研究方案，開展對試劑盒和新增適用儀器組合的研究，詳細記錄研究過程和結(jié)果以及得出結(jié)論。另外，技術(shù)審評鼓勵注冊人盡可能系統(tǒng)全面的分析和論證各類證據(jù)用于支持增加適用儀器的科學(xué)合理性。
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注冊人可以通過基于產(chǎn)品風(fēng)險的評估，相應(yīng)地進行設(shè)計變更的驗證與確認，分析并評價新增加的適用儀器對產(chǎn)品說明書聲稱的分析性能和臨床性能的影響。其中分析性能包括對于試劑盒的性能以及試劑盒和儀器組合性能的評估驗證，前者例如準(zhǔn)確度、檢測限、精密度、線性或溯源性等，后者例如攜帶或交叉污染、機載試劑和定標(biāo)液穩(wěn)定性或鉤狀效應(yīng)等。同時應(yīng)研究確認對于臨床性能的影響，例如是否改變預(yù)期適用人群的參考區(qū)間或者陽性判斷值。另外還包括對臨床適應(yīng)癥的影響，例如在定性、半定量和定量結(jié)果判讀更改，樣本類型的更改或者增加高靈敏度性能的情況下評價診斷靈敏度和特異性、陰陽性符合率和總符合率等關(guān)鍵臨床參數(shù)。
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根據(jù)上述對于試劑盒和儀器組合進行評估的驗證或確認研究，在結(jié)果顯示變更對產(chǎn)品的安全有效性不造成顯著影響，并且不引發(fā)新的風(fēng)險或者顯著改變現(xiàn)有風(fēng)險的情況下，注冊人即可以產(chǎn)品許可事項變更的形式進行注冊申報。
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這里值得注意的是，在影響醫(yī)療決策制定，也就是顯著改變臨床性能的情況下，基于對產(chǎn)品臨床使用過程中潛在風(fēng)險的考慮，建議注冊人將變更后的試劑盒按照新產(chǎn)品進行注冊申報。
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三、其他國家的監(jiān)管情況
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對于類似的情況，美國FDA于2003年發(fā)布了儀器替代家族政策,并于2017年12月進行了更新。適用范圍是已獲批的體外診斷試劑產(chǎn)品增加適用儀器的情況，前提是適用儀器已上市或者與已獲批的設(shè)備屬于同一個儀器家族。這里的儀器家族是指具有相同的結(jié)構(gòu)、設(shè)計、電氣安全和電磁兼容性能以及功能（如檢測方法、信號范圍和強度以及反應(yīng)條件）的設(shè)備系列；試劑和儀器可以是相同或者不同廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品。注冊人應(yīng)當(dāng)根據(jù)檢測試劑盒的質(zhì)量體系要求評估試劑盒和新增適用儀器組合的性能，以確保申報的檢測系統(tǒng)具有可接受的性能。此外，試劑盒的注冊人負責(zé)確保經(jīng)調(diào)整或更改的檢測系統(tǒng)能夠持續(xù)滿足設(shè)計驗收標(biāo)準(zhǔn)。
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對于試劑盒和新增適用儀器組合的性能研究,也就是將已獲批的檢測系統(tǒng)的性能轉(zhuǎn)移到新的檢測系統(tǒng)后的評價路徑,美國FDA也發(fā)布了相關(guān)的技術(shù)指南性文件,并建議將研究結(jié)果納入PMA（上市前批準(zhǔn)）補充文件或新的510（k）（上市前通告）文件。包括定性檢測和定量檢測產(chǎn)品的轉(zhuǎn)移研究，其中定性檢測應(yīng)評估產(chǎn)品的診斷靈敏度、精密度以及使用臨床樣本進行比較研究等；定量檢測應(yīng)評估產(chǎn)品的分析靈敏度、精密度、線性范圍以及使用臨床樣本進行方法學(xué)比對研究等。
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根據(jù)上述對于試劑盒和儀器組合進行評估的驗證或確認研究，在結(jié)果顯示變更對產(chǎn)品的安全有效性不造成顯著影響，并且不引發(fā)新的風(fēng)險或者顯著改變現(xiàn)有風(fēng)險的情況下，注冊人即可考慮將檢測試劑盒應(yīng)用于儀器家族的新成員，并按照質(zhì)量管理體系的要求進行相應(yīng)的文件記錄或者提交PMA（上市前批準(zhǔn)）補充文件申請。
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如果發(fā)生下屬情形之一，美國FDA則要求注冊人提交新的510（k）或者PMA申請。第一種情況是體外診斷試劑的技術(shù)原理發(fā)生改變,包括反應(yīng)原理（如雙抗原夾心法、雜交捕獲法），檢測模式（如化學(xué)發(fā)光法、比濁法），測量方法（如終點/速率、定性/定量），信號處理方法，數(shù)據(jù)獲取和解讀方式，分析前處理步驟等。第二種情況是主要原材料或關(guān)鍵反應(yīng)成分發(fā)生更換,包括抗原-抗體、酶-底物、結(jié)合物、信號標(biāo)記物、固相載體、引物-探針、目標(biāo)物分離（如核酸提?。┙M分等。
全面了解艾滋病病毒檢測試劑
相關(guān)背景
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2019年12月1日是第32個“世界艾滋病日”，我國宣傳活動的主題是“社區(qū)動員同防艾，健康中國我行動”。目前，我國艾滋病防控任務(wù)依然艱巨。
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艾滋病的診斷原則是以實驗室檢測為依據(jù)，結(jié)合臨床表現(xiàn)并參考流行病學(xué)資料綜合進行。本文對艾滋病病毒檢測試劑的主要種類及各自的用途特點進行介紹，幫您全面了解艾滋病病毒檢測試劑和檢測方法。
艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodef i ci ency syndr ome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒（human i mmunodef i c i ency vi r us，HI V）也就是艾滋病病毒感染引起的，以人體CD4+T淋巴細胞減少為特征的進行性免疫功能缺陷，疾病后期可繼發(fā)各種機會性感染、惡性腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變等，病死率較高。
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目前，艾滋病是威脅我國公眾健康的重要公共衛(wèi)生問題。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心、聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署、世界衛(wèi)生組織聯(lián)合評估，我國新發(fā)感染者每年在8萬例左右，截至2018年底，我國估計存活艾滋病感染者約125萬，全人群感染率約9人/萬人。
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HIV檢測試劑根據(jù)檢測目標(biāo)物的不同大致分為：抗體檢測試劑、抗原檢測試劑、核酸檢測試劑和HIV基因型耐藥檢測試劑。通常人們也會根據(jù)檢測試劑的使用特點、用途、性能等，將其進行歸類，如HIV抗體快速檢測試劑、HIV自測試劑、HIV抗體篩查試劑、HIV抗體診斷試劑、HIV抗體確證試劑等。檢測的樣本類型包括血液、尿液、口腔黏膜滲出液等。
一、HIV檢測試劑分類：
1.發(fā)光類檢測試劑
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從HIV感染人體到感染者血清中的HIV抗體、抗原或核酸等感染標(biāo)志物能被檢測出之前的時期，稱為艾滋病的窗口期。此階段的感染者具有傳染性，但無法被檢測手段識別。隨著檢測手段的迭代更新，艾滋病窗口期被一再縮短。目前市場上的主流艾滋病輔助診斷試劑為第三代發(fā)光類檢測試劑和第四代發(fā)光類檢測試劑。第三代試劑檢測的是HIV-IgG和HIV-IgM抗體，窗口期3周左右；第四代試劑同時檢測HIV抗體和p24抗原，窗口期2周左右。
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2.抗體快速檢測試劑
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目前已有多家生產(chǎn)商生產(chǎn)的快速檢測試劑獲批上市。此類試劑采用膠體金等免疫層析技術(shù)原理，檢測受試者血液、口腔黏膜滲出液等樣本中的HIV抗體。快速檢測試劑一般只需20分鐘即可獲得結(jié)果。然而，快速檢測并不等同于早期診斷，并不能更早地發(fā)現(xiàn)HIV感染。相反，基于該檢測方法的局限性，當(dāng)采用非血液樣本進行檢測時，應(yīng)謹慎可能出現(xiàn)的假陰性及假陽性結(jié)果。
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3.自測試劑
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擴大檢測（盡可能多地發(fā)現(xiàn)AIDS患者/HIV感染者）是我國預(yù)防控制艾滋病的核心策略。由于此疾病的隱匿性，及社會歧視、恥辱感等的存在，高危人群獲得上述醫(yī)學(xué)專業(yè)實驗室檢測的覆蓋率仍不足。
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今年7月，我國首次批準(zhǔn)了可用于消費者自測用途的HIV尿液抗體檢測試劑。與上述其他檢測試劑不同，自測試劑在試劑性能滿足要求的基礎(chǔ)上，其產(chǎn)品設(shè)計更易操作，說明書編寫更為通俗，適合無專業(yè)背景的人使用。此類試劑在上市前臨床試驗研究中，對目標(biāo)用戶在醫(yī)院及家中等可能應(yīng)用的場景進行自檢試驗，并進行了消費者對說明書、標(biāo)簽等關(guān)鍵信息的調(diào)查問卷試驗，確認了無專業(yè)背景消費者使用時檢測結(jié)果的可靠性。
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4.HIV抗體確證試驗試劑
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上述發(fā)光類檢測試劑、抗體快速檢測試劑和抗體自測試劑，都屬于抗體初篩試驗類試劑范疇，但人們無法僅根據(jù)初篩試驗結(jié)果給出受試者感染HIV的結(jié)論。臨床中，對初篩陽性人群，需采用包括免疫印跡法(WB)，條帶/線性免疫試驗（RIBA/LIA），間接免疫熒光(IFA)等方法進行復(fù)檢試驗，此類試劑被稱為HIV抗體確證試驗試劑。
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5.HIV核酸檢測試劑
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患者感染HIV后，病毒在其體內(nèi)快速復(fù)制，當(dāng)血液中的病毒RNA高于核酸檢測試劑檢測下限時，HIV核酸檢測結(jié)果呈陽性，此時可結(jié)合流行病學(xué)史、臨床癥狀及HIV抗體初篩結(jié)果作出判斷。目前認為HIV核酸檢測的窗口期可縮短至1周左右。
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除上述初篩用途外，HIV核酸定量檢測試劑還可用于臨床管理HIV感染的患者。具體來說，可通過測定基線HIV-1RNA水平，對患者的預(yù)后進行評價；或在抗病毒治療過程中通過測定患者血液中HIV-1RNA水平的變化來監(jiān)控抗病毒治療的效果。
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6.HIV基因型耐藥檢測試劑
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HIV耐藥檢測結(jié)果可為艾滋病治療方案的制訂和調(diào)整提供重要參考。檢測結(jié)果為HIV耐藥，表示該感染者體內(nèi)病毒可能耐藥，同時需密切結(jié)合臨床情況，充分考慮HIV感染者的依從性，對藥物的耐受性及藥物代謝吸收等因素進行綜合評判。
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二、注意事項
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HIV感染的高風(fēng)險人群包括有男男同性性行為者，靜脈注射毒品者，與HIV/AIDS患者有性接觸者，多性伴人群，懷疑接受過不潔輸血、使用過未經(jīng)嚴格消毒的針具注射的人等。當(dāng)以上人群出現(xiàn)發(fā)燒、皮疹、疲勞、頭痛、腹瀉、淋巴結(jié)腫大等癥狀，或懷疑自己可能感染HIV時，可到設(shè)置于當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu)或指定醫(yī)療機構(gòu)的艾滋病自愿咨詢檢測（VCT）門診/室，接受免費且保密的咨詢和檢測，也可自行購買自測抗體檢測試劑，進行自我檢測。
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消費者進行自我檢測時應(yīng)特別注意：由于疾病窗口期的存在、HIV變異或樣本處理不當(dāng)?shù)纫蛩?，若檢測結(jié)果為陰性，并不能排除HIV感染的可能性。如果自我檢測距離最近一次高危行為的時間間隔在窗口期內(nèi)，建議隔一段時間再自行檢測，或到當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu)或醫(yī)療機構(gòu)咨詢檢測。若自我檢測結(jié)果呈陽性，也無需過分恐慌，因為自我檢測結(jié)果僅為初篩結(jié)果，并不能判定檢測者已感染HIV，此時，應(yīng)向所在地的疾病預(yù)防控制機構(gòu)或醫(yī)療機構(gòu)進行咨詢，并做進一步檢測來確診HIV感染狀態(tài)。
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目前，國家已批準(zhǔn)了多個用于HIV感染檢測的試劑，用途覆蓋艾滋病的診斷、病情監(jiān)測和用藥指導(dǎo)。就使用人群來區(qū)分，獲批產(chǎn)品包括實驗室檢測試劑和消費者自測試劑。需注意的是，目前可選擇的所有檢測試劑都有各自的用途和局限性，使用時應(yīng)根據(jù)用途和行業(yè)技術(shù)規(guī)范，確定HIV感染檢測策略。
微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測概述
一、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）簡介
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微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（Microsatellite Instability，MSI），是指由于在DNA復(fù)制時插入或缺失突變引起的微衛(wèi)星（Microsatellite, MS）序列長度改變的現(xiàn)象，常由錯配修復(fù)功能（Mismatch repair, MMR）缺陷引起。MS序列，是一些短而重復(fù)的DNA序列，一般由1～6個核苷酸組成，串聯(lián)重復(fù)排列，常見類型為雙堿基CA/GA/GT或單堿基A/T等。MS序列可以位于基因的重要非編碼區(qū)，也可以位于基因的編碼區(qū)，多態(tài)性分布于整個基因組，個體差異大。
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MSI現(xiàn)象于1993年被Jacobs等人在結(jié)直腸癌中首次發(fā)現(xiàn)。隨著針對MSI的研究深入，發(fā)現(xiàn)MSI現(xiàn)象不止存在于結(jié)直腸癌，在子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肝細胞癌、乳腺癌等實體瘤中均有發(fā)生。
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二、MSI檢測方法
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目前檢測癌細胞中的MSI時，既可以通過檢測MMR基因缺失來確定是否發(fā)生MSI，如依賴于免疫組化技術(shù)的蛋白水平檢測，也可以直接檢測MSI的序列變化，如PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）檢測等的分子水平檢測。
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（一）免疫組化方法（Immunohistochemistry, IHC）
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常見的方法為采用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織中錯配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達。任何一項錯配修復(fù)基因表達缺失，被定義為MSI，否則即為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。其中一個表達缺失則稱為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L)，2種或2種以上蛋白表達缺失為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)。
此方法檢測MSI相對較簡單，成本較低。但存在一些問題，如使用抗體的不一致、病理醫(yī)生的閱片標(biāo)準(zhǔn)不一致等。
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（二）分子水平的檢測
1.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)
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目前主要采用多重?zé)晒釶CR結(jié)合毛細管電泳的方法。通過PCR方法檢測特異的微衛(wèi)星重復(fù)序列擴增判定MSI狀態(tài)，比較腫瘤患者的標(biāo)本組織與正常組織的位點突變情況。其比較的位點為美國國家癌癥研究所（NCI）推薦的5個微衛(wèi)星位點：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2個位點發(fā)生改變判定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），僅1個位點發(fā)生改變判定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L），無位點改變判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。有研究認為，二核苷酸重復(fù)序列的特異性和靈敏度比單核苷酸重復(fù)序列要低，因此關(guān)于最適合MSI檢測的位點仍存在爭議。Bacher等對266個微衛(wèi)星位點(其中包括單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸以及五核苷酸微衛(wèi)星位點)檢測的敏感性及準(zhǔn)確性進行評估，提出了Promega分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用五個單核苷酸微衛(wèi)星位點(BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27)及兩個五核苷酸微衛(wèi)星位點(Penta C和Penta D)檢測MSI。
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大量的實驗證實，MMR免疫組化檢測結(jié)果與MS的PCR檢測結(jié)果有高度關(guān)聯(lián)性，靈敏度92%，特異性可達100%。
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該方法目前是檢測MSI的方法學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作過程復(fù)雜，花費較高，且在結(jié)果判斷中會碰到以下問題，如熒光的過強或過少、非特異性峰、不顯著的峰大小改變，雜合性缺失等。
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2.新一代測序方法（Next Generation Sequencing, NGS）
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NGS又稱為第二代測序技術(shù)，是一種高通量測序技術(shù)，能一次性對幾十萬到幾百萬條基因分子進行序列測定。目前NGS方法已經(jīng)成為檢測MSI的新工具，其最大優(yōu)勢是可以實現(xiàn)多位點高通量檢測。紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSK）的一項研究使用NGS方法對12,288例實體瘤病人進行檢測，判定MSI狀態(tài)，并用MSI-PCR/MMR-IHC進行了驗證。實驗證明, NGS方法較MSI-PCR方法具有更高的敏感性。
三、MSI檢測的臨床意義
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目前，有關(guān)MSI檢測的臨床意義有如下觀點：
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（一）Lynch綜合征的篩查
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Lynch綜合征，亦稱遺傳非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），是一種呈家族遺傳傾向的常染色體顯性遺傳病，由于MMR基因發(fā)生胚系突變所致，約占所有結(jié)直腸癌（Colorectal carcinoma, CRC）3%～5%。Lynch綜合征最突出的特點之一是攜帶者本人或家族成員可發(fā)生CRC及其他多種Lynch相關(guān)腫瘤。MSI是Lynch綜合征的特征性分子，約90%以上表現(xiàn)出MSI。同時并不是所有的MSI均是Lynch綜合征，在散發(fā)性CRC中也存在10%～15%的MSI。
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（二）MSI與結(jié)直腸癌的預(yù)后
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臨床研究證實，MSI與結(jié)直腸癌的預(yù)后有著密切的關(guān)系。MSI-H結(jié)直腸癌患者相比MSS患者具有顯著的生存優(yōu)勢，臨床表現(xiàn)較差，但預(yù)后更好。研究證實，針對Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，MSI-H患者的總生存期及無病生存期明顯延長。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）發(fā)布的結(jié)直腸癌指南，建議MSI檢測應(yīng)在所有結(jié)直腸癌史的病人中進行。
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（三）MSI與指導(dǎo)用藥
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研究證實，MSI-H的結(jié)直腸癌Ⅱ期患者不能在氟尿嘧啶（5-FU）治療中獲益。同時因MSI-H的晚期結(jié)直腸癌患者通常具有PD-1及PDL-1等的高表達，可通過對PD-1/PD-L1的靶向抑制，促使機體免疫系統(tǒng)攻擊和殺滅腫瘤細胞。目前美國FDA已批準(zhǔn)PD-1免疫治療單抗pembrolizumab、ipilimumab和nivolumab用于具有錯配修復(fù)缺陷（dMMR）/MSI-H表型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）的末線治療。除了mCRC的治療外，2017年5月，美國FDA批準(zhǔn)了PD-1抗體pembrolizumab用于治療成人和兒童具有dMMR/MSI-H表型的沒有其他治療選擇的，不可切除或轉(zhuǎn)移性實體瘤患者。
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《中國結(jié)直腸癌診療指南》（2010版）就明確了“Ⅱ期結(jié)直腸癌，有條件者建議檢測組織標(biāo)本MMR或MSI，如為dMMR或MSI-H，不推薦氟尿嘧啶類藥物的單藥輔助化療”。在《中國結(jié)直腸癌診療指南》（2017版）的組織病理學(xué)檢查部分，增加了MMR或MSI的檢測作為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的推薦檢測方法，“確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌時，推薦檢測腫瘤組織K-ras及N-ras基因、BRAF基因、錯配修復(fù)蛋白表達或微衛(wèi)星狀態(tài)及其他相關(guān)基因狀態(tài)以指導(dǎo)進一步治療。”
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四、相關(guān)檢測產(chǎn)品介紹
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目前國際上已上市的產(chǎn)品有：
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（一）MSI-IVD Kit (FALCO)
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日本FALCO公司的MSI-IVD Kit已獲得日本厚生勞動省的批準(zhǔn)上市。該試劑盒采用PCR技術(shù)檢測癌組織中提取的基因組DNA中的MSI狀態(tài)，檢測7個微衛(wèi)星位點（五個單核苷酸微衛(wèi)星位點BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27及兩個五核苷酸微衛(wèi)星位點Penta C和Penta D）。該產(chǎn)品由日本FALCO公司與Promega公司合作開發(fā)，作為伴隨診斷試劑，用于指導(dǎo)PD-1抗體pembrolizumab在局部晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥患者中的應(yīng)用。
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（二）VENTANA MMR IHC panel
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該產(chǎn)品采用IHC方法檢測經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋的結(jié)直腸癌組織切片中的四種MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，及BRAF V600E
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突變蛋白。用于Lynch綜合征的輔助診斷，同時檢測BRAF V600E突變蛋白用于散發(fā)性CRC及Lynch綜合征的輔助鑒別診斷。此產(chǎn)品通過De Novo途徑在美國上市。
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（三）MSK-IMPACTTM
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2017年11月16日，美國FDA批準(zhǔn)紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，簡稱MSK）基于二代測序技術(shù)的癌癥基因檢測分析平臺MSK-IMPACTTM。該產(chǎn)品能夠一次對病人腫瘤468個基因的突變進行檢測，并且可以檢測MSI基因組特征。該產(chǎn)品僅限于在MSK中進行使用，其檢測結(jié)果不與任何藥物聯(lián)用。該產(chǎn)品的MSI的檢測性能通過對10,900名患有66種不同類型晚期實體瘤患者的研究進行確定。
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（四）FoundationOne CDx (F1CDx)
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2017年11月30日，美國FDA批準(zhǔn)了Foundation Medicine公司針對多種實體瘤的二代測序的體外檢測產(chǎn)品—FoundationOne CDx（F1CDx）。該產(chǎn)品僅允許在Foundation Medicine公司進行檢測。這款產(chǎn)品除了可檢測5種腫瘤中的324個基因的突變，還可以檢測MSI和腫瘤突變負荷（TMB）兩個基因組特征，是FDA批準(zhǔn)的首款獲得突破性認定的癌癥NGS體外診斷檢測產(chǎn)品。
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五、總結(jié)
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隨著研究的進一步深入，MSI在腫瘤的發(fā)生機制中所起的作用越來越被人們所關(guān)注。雖然近年來MSI的檢測在臨床應(yīng)用方面被日趨關(guān)注，但是國內(nèi)還未有注冊獲批的產(chǎn)品。2018年已有MSI檢測試劑盒通過國家藥品監(jiān)督管理局的創(chuàng)新醫(yī)療器械特別審查程序，該產(chǎn)品采用熒光PCR-毛細管電泳法。
如何判定一個體外診斷試劑是否屬于防治罕見病相關(guān)產(chǎn)品
體外診斷試劑產(chǎn)品是否屬于防治罕見病相關(guān)產(chǎn)品，應(yīng)依據(jù)《罕見病防治醫(yī)療器械注冊審查指導(dǎo)原則》（2018年第101號）、《關(guān)于公布第一批罕見病目錄的通知》（國衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2018〕10號）及《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)罕見病診療指南（2019年版）的通知》（國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2019〕198號）等文件判定。如申報產(chǎn)品臨床適用癥為第一批罕見病目錄中的疾病，且依據(jù)罕見病診療指南（2019年版），該疾病的診療流程中需進行申報產(chǎn)品對應(yīng)的檢測項目的檢測，則該產(chǎn)品可認定為防治罕見病相關(guān)產(chǎn)品。對于申報產(chǎn)品檢測項目為新研發(fā)的生物標(biāo)志物，應(yīng)明確產(chǎn)品預(yù)期用途及其與相關(guān)罕見病診療的關(guān)系,從而判定其是否屬于防治罕見病的產(chǎn)品
血氣檢測類產(chǎn)品適用的樣本類型是什么
臨床應(yīng)用中，血氣檢測類產(chǎn)品（包括儀器和試劑）的樣本類型一般為動脈全血。審評過程中依據(jù)注冊申報資料的驗證內(nèi)容，一般將適用樣本類型明確為動脈全血。如果產(chǎn)品適用于檢測靜脈全血、毛細血管全血等其他樣本類型，亦應(yīng)進行充分驗證。
體外診斷試劑的配套質(zhì)控品有何要求
體外診斷試劑的配套質(zhì)控品用于對檢測系統(tǒng)進行質(zhì)量控制。申請人應(yīng)對申報試劑檢測質(zhì)控品的預(yù)期結(jié)果（靶值和靶值范圍）進行驗證，并將經(jīng)驗證的配套質(zhì)控品在試劑說明書中予以明確。未經(jīng)驗證的“第三方質(zhì)控品”、“其他商用質(zhì)控品”等表述不應(yīng)出現(xiàn)在產(chǎn)品說明書中。
體外診斷試劑臨床試驗中，能否采用境外已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑
體外診斷試劑的臨床試驗一般采用試驗用體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)和/或已上市同類產(chǎn)品進行比較研究的方法，評價試驗用體外診斷試劑的臨床性能，為該產(chǎn)品安全、有效性的確認提供科學(xué)有效的臨床證據(jù)。其中，“已上市同類產(chǎn)品”指的是境內(nèi)批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品。
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對于目前臨床上沒有可參照的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)或現(xiàn)有臨床參考標(biāo)準(zhǔn)不能全面評價產(chǎn)品臨床性能的情況，臨床試驗設(shè)計時，在確認被測物臨床檢測意義的前提下，還應(yīng)依據(jù)現(xiàn)有臨床實踐和理論基礎(chǔ)選擇適當(dāng)?shù)膶嶒炇曳椒ㄟM行檢測性能評價，例如：與臨床公認的、標(biāo)準(zhǔn)化的實驗室參考方法進行對比試驗。如果有境外已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品，與試驗用體外診斷試劑具有相同的預(yù)期用途，且該產(chǎn)品經(jīng)過了充分的性能驗證和確認，實驗室檢測過程中可實現(xiàn)良好的質(zhì)量控制，并被臨床廣泛認可能夠用于相關(guān)標(biāo)志物檢測，則該產(chǎn)品亦可作為實驗室檢測方法用作對比方法。
eRPS系統(tǒng)注冊申報申請表中IVD產(chǎn)品分類編碼應(yīng)如何選擇
按照《關(guān)于實施醫(yī)療器械注冊電子申報的公告》（2019年第46號）的要求，自2019年6月24日，正式啟用eRPS系統(tǒng)。eRPS系統(tǒng)中，體外診斷試劑申請表分類編碼一欄除固定6840外,增加了對6840細化的產(chǎn)品類別名稱,申請人/注冊人可在下拉菜單中選擇。以下就該細化的分類編碼的選擇逐一說明：
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1、23-001：與中華人民共和國傳染病防治法所述疾病相關(guān)的病原體檢測試劑；
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此類產(chǎn)品僅包括《中華人民共和國傳染病防治法》中所規(guī)定的甲類、乙類和丙類傳染病相關(guān)的病原體檢測試劑。
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2、23-002：除23-001外其它致病性病原體抗原、抗體以及核酸等相關(guān)的檢測試劑；
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本類產(chǎn)品包括除《中華人民共和國傳染病防治法》中所規(guī)定的甲類、乙類和丙類傳染病以外的其他致病性病原體相關(guān)的檢測試劑，如幽門螺桿菌、沙眼衣原體、白色念珠菌、人乳頭瘤病毒、EB病毒、單純皰疹病毒等。
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3、23-003：與血型、組織配型相關(guān)的檢測試劑；
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本類產(chǎn)品指ABO、Rh等血型檢測試劑、血小板抗體、抗人球蛋白、紅細胞抗體檢測試劑以及HLA-DNA分型檢測試劑等。
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4、23-004：與人類基因、遺傳性疾病相關(guān)的檢測試劑；
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如染色體非整倍體(DNA)、CYP2C19基因等人類基因相關(guān)的檢測試劑以及遺傳性耳聾基因檢測、苯丙氨酸檢測等遺傳性疾病相關(guān)的檢測試劑。
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5、23-005：與免疫組化、原位雜交、流式細胞分析儀配套相關(guān)檢測試劑；
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指采用免疫組化、原位雜交、流式技術(shù)的相關(guān)檢測試劑，且依據(jù)《總局關(guān)于過敏原類、流式細胞儀配套用、免疫組化和原位雜交類體外診斷試劑產(chǎn)品屬性及類別調(diào)整的通告》（2017年第226號）按照第二類和第三類體外診斷試劑管理的產(chǎn)品；
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6、23-006：除列入免臨床目錄的腫瘤標(biāo)志物以外的其它與腫瘤相關(guān)的檢測試劑；
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本類產(chǎn)品是指除列入免臨床目錄的腫瘤標(biāo)志物以外的其他腫瘤相關(guān)檢測試劑，如甲基化檢測等。
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7、23-007：列入免臨床目錄的腫瘤標(biāo)志物相關(guān)的檢測試劑；
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本類產(chǎn)品僅包括已列入免臨床目錄的腫瘤標(biāo)志物相關(guān)的檢測試劑，如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）等。
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8、 24-001：用于蛋白質(zhì)檢測的試劑；
??24-002：用于糖類檢測的試劑；
??24-003：用于激素檢測的試劑；
??24-004：用于酶類檢測的試劑；
??24-005：用于酯類檢測的試劑；
??24-006：用于維生素檢測的試劑；
??24-007：用于無機離子檢測的試劑；
??24-008：用于藥物及藥物代謝物檢測的試劑；
??24-009：用于自身抗體檢測的試劑；
??24-010：用于變態(tài)反應(yīng)（過敏原）檢測的試劑；
??24-011：與麻醉藥品、精神藥品、醫(yī)療用毒性藥品檢測相關(guān)的試劑；
??24-012：用于其他生理、生化或者免疫功能指標(biāo)檢測的試劑；
??24-013：用于微生物鑒別或者藥敏試驗的試劑；
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自24-001至24-013，與《6840體外診斷試劑分類子目錄》（2013版）一致。
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以上細分的IVD分類編碼對于申報資料提交至eRPS系統(tǒng)后能否進入正確的分配路徑至關(guān)重要，申請人/注冊人應(yīng)重視并正確進行選擇，如出現(xiàn)選擇錯誤的情況，請于立卷審查環(huán)節(jié)發(fā)補后進行更正。
體外診斷試劑產(chǎn)品技術(shù)要求附錄中主要原材料的供應(yīng)商該如何填寫
體外診斷試劑產(chǎn)品技術(shù)要求附錄中要求標(biāo)注主要原材料的來源,如為外購應(yīng)寫明供應(yīng)商。此處的供應(yīng)商應(yīng)為原材料的生產(chǎn)商,而不是經(jīng)銷商或代理商。相應(yīng)的，注冊變更情形中主要原材料的供應(yīng)商的變更是指原材料的生產(chǎn)商發(fā)生變化的情形。
體外診斷試劑臨床試驗中如采用核酸序列測定、GC-MS/MS等實驗室檢測參考方法作為對比方法進行比較研究,是否可以委托測試
對于某些目前臨床上尚不存在明確的臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，亦無可比的同類產(chǎn)品上市的體外診斷試劑，臨床試驗研究者應(yīng)依據(jù)現(xiàn)有臨床實踐和理論基礎(chǔ)，建立合理的方法，進行比較研究。對于部分體外診斷試劑，臨床試驗中采用核酸序列測定、GC-MS/MS等實驗室檢測參考方法作為對比方法進行比較研究，這些方法非臨床常規(guī)檢測技術(shù)，需要專門的設(shè)備儀器和試驗條件，且臨床試驗機構(gòu)可能不具備相關(guān)檢測條件。對于此類情況，申請人應(yīng)盡可能選擇具備相應(yīng)條件的臨床試驗機構(gòu)開展臨床試驗，確無檢測條件的部分臨床試驗機構(gòu)可將此部分測試委托給專門的測序機構(gòu)、具備一定檢測資質(zhì)的實驗室進行檢測，并對檢測結(jié)果進行認可。應(yīng)提交臨床試驗機構(gòu)與受委托機構(gòu)的委托證明文件，并評價對比方法的方法學(xué)研究和整體質(zhì)量。不得委托申請人的實驗室進行相關(guān)測試。
新研制試劑的配套專用儀器尚未取得注冊證，是否可以申請試劑注冊
對于新研制體外診斷試劑及其配套專用儀器，由于分屬不同的法規(guī)管理，因此需分別提交注冊申請。但試劑及其專用儀器檢測性能的驗證和確認是密不可分的整體驗證過程，因此，在試劑和儀器均已定型的情況下，并不限定試劑和其配套專用儀器的上市順序。但試劑注冊申請時，應(yīng)能夠確保配套儀器及檢測系統(tǒng)定型，如使用非本企業(yè)生產(chǎn)的儀器，則所使用配套儀器應(yīng)已作為醫(yī)療器械在中國境內(nèi)上市，并能夠?qū)ζ湓谂涮變x器上的性能進行全面驗證和確認。
體外診斷試劑臨床試驗中能否使用凍存樣本
體外診斷試劑產(chǎn)品臨床試驗中需使用符合入組標(biāo)準(zhǔn)的病例樣本進行試驗，在具體樣本入組時除注意病例的選擇外（此部分內(nèi)容見共性問題“關(guān)于體外診斷試劑臨床試驗入組病例樣本的常見問題”），還應(yīng)注意樣本的保存條件。原則上，臨床試驗樣本的使用應(yīng)最大可能與試劑臨床使用過程中樣本的狀態(tài)一致，如臨床使用狀態(tài)為新鮮采集后檢測，則應(yīng)考慮使用新鮮采集的樣本進行臨床試驗。如臨床使用過程中可能存在樣本保存過程（如一定條件下凍存），且說明書中樣本保存條件明確了相應(yīng)的樣本保存條件及有效期，則臨床試驗中亦可納入部分相應(yīng)保存條件下的樣本。無論使用新鮮采集樣本還是凍存樣本，均應(yīng)確保入組樣本的保存條件和期限符合相應(yīng)產(chǎn)品樣本保存的要求。
體外診斷試劑產(chǎn)品說明書“標(biāo)識的解釋”項涉及修改如何執(zhí)行
按照《總局辦公廳關(guān)于體外診斷試劑說明書文字性變更有關(guān)問題的通知》（食藥監(jiān)辦械管[2016]117號），體外診斷試劑說明書信息性內(nèi)容的文字性變化可由注冊人自行修改，其中包括體外診斷試劑說明書“標(biāo)識的解釋”項目，因注冊人按照YY/T0466系列標(biāo)準(zhǔn)完善體外診斷試劑說明書中相應(yīng)標(biāo)識的解釋內(nèi)容，導(dǎo)致該項內(nèi)容變化，但不涉及其他需辦理許可事項變更的情況，注冊人應(yīng)自行修改。此處YY/T0466系列標(biāo)準(zhǔn)可為YY/T0466系列標(biāo)準(zhǔn)或其對應(yīng)的ISO 15223標(biāo)準(zhǔn)。如注冊人自行修改，應(yīng)在延續(xù)注冊時予以說明。
