ELISA（酶聯(lián)免疫）的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。

進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，樣品中的受檢物質(zhì)（抗原或抗體）與固定的抗體或抗原結(jié)合。通過(guò)洗板除去非結(jié)合物，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，此時(shí)，能固定下來(lái)的酶量與樣品中被檢物質(zhì)的量相關(guān)。通過(guò)加入與酶反應(yīng)的底物后顯色，根據(jù)顏色的深淺可以判斷樣品中物質(zhì)的含量，進(jìn)行定性或定量的分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的靈敏度。

目前在體外診斷免疫學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域中，ELISA因其敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，又因其使用試劑穩(wěn)定、易保存而被廣泛使用于抗原/抗體定量檢測(cè)。

ELISA原理雖然是基于免疫學(xué)中抗體抗原的特異性結(jié)合，然而實(shí)際應(yīng)用中，仍然需要根據(jù)抗體抗原的特性設(shè)計(jì)不同的檢測(cè)法。除卻雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法這兩種最為廣泛應(yīng)用的檢測(cè)法之外，還會(huì)介紹其他檢測(cè)法。

夾心法

也稱為“三明治”ELISA，可用來(lái)定量許多皮克到微克級(jí)別的物質(zhì)（如激素，細(xì)胞信號(hào)化學(xué)物質(zhì)，傳染病抗原和細(xì)胞因子）。通常來(lái)說(shuō)，雙抗體夾心法用于檢測(cè)較大分子的抗原，同理，雙抗原也能檢測(cè)大分子抗體。所謂的雙抗體，第一個(gè)抗體則是包被在固相載體上的，通過(guò)特異性結(jié)合捕獲抗原；而第二個(gè)抗體，也被稱為標(biāo)記抗體，帶有酶標(biāo)，通過(guò)催化底物進(jìn)行顯色，通過(guò)樣本吸光度來(lái)鑒定抗原濃度。

圖1：ELISA夾心法實(shí)驗(yàn)流程示意圖

直接競(jìng)爭(zhēng)法

此法一般適用于小分子或只有一個(gè)表位或重復(fù)表位的抗原。在包被抗體后將分為兩組，a組加入酶標(biāo)抗原和被檢抗原，b組則只加入被檢抗原。所謂競(jìng)爭(zhēng)，則是在a組中，酶標(biāo)抗原與被檢抗原互相競(jìng)爭(zhēng)和包被的抗體結(jié)合。最后通過(guò)底物顯色得出兩組之間的差值，便是被檢抗原的濃度。??

圖2：ELISA競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)驗(yàn)流程示意圖

免疫抑制法

免疫抑制法雖然也是檢測(cè)樣本中特定抗原濃度，但它在固相載體上包被的是抗原而非抗體。如競(jìng)爭(zhēng)法，包被后分為兩組，a組加入?yún)⒖伎贵w與被檢抗原；被檢抗原雖然會(huì)與抗體結(jié)合，但因?yàn)闆](méi)有被固定在載體上，因此在洗滌階段會(huì)被除去。通過(guò)加入抗體的酶結(jié)合物做顯色測(cè)定，最后與B組的結(jié)果差值則為被檢抗體含量。有趣的是，前兩種方法都是顯色程度越高，被檢物含量越高，而免疫抑制法恰恰相反，測(cè)定組顯色越低，說(shuō)明被檢抗原濃度越高。

圖3：ELISA免疫抑制法實(shí)驗(yàn)流程示意圖

直接法&間接法

直接法利用抗原結(jié)合在固定抗體商，再用酶連抗體直接與抗原結(jié)合，而后分解底物。

間接法是利用受檢抗體與固相抗原結(jié)合后，再進(jìn)行酶標(biāo)做底物顯色。

圖4：ELISA直接法實(shí)驗(yàn)流程示意圖

在開發(fā)ELISA相關(guān)試劑時(shí)，除卻優(yōu)化抗原或捕獲抗體在固相材料上的包被條件以期最大限度地把有效蛋白包被到固相材料表面之外，還需要盡可能利用封閉劑將固相材料表面未占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)封閉以防止非特異性結(jié)合。

圖5：未使用與使用封閉劑的抗原抗體結(jié)合情況比較

理想的封閉劑需具有：

?? 有效地阻斷測(cè)定反應(yīng)物非特異性結(jié)合到固體材料表面

?? 不影響已包被到固體材料表面的試劑有效成分

?? 可以起到試劑有效成分在固相表面穩(wěn)定劑（防止變性）的作用

?? 不與其它試劑有效成分發(fā)生交叉反應(yīng)

?? 不具有酶活性并由此可能與試劑中的底物反應(yīng)而使信號(hào)加強(qiáng)或降解試劑中的反應(yīng)物

?? 批間差異小

Sigma-Aldrich^?（現(xiàn)默克生命科學(xué)下屬的子品牌，以下簡(jiǎn)稱sigma）提供的高純度凍干BSA均能滿足以上要求。此款BSA來(lái)源于新西蘭初級(jí)產(chǎn)業(yè)部(MPI)認(rèn)證過(guò)的健康動(dòng)物源血漿。通過(guò)利用獨(dú)有的非溶劑型專利技術(shù)，將白蛋白從血漿蛋白和脂質(zhì)中分離出來(lái)；分離過(guò)程包含改良的Cohn/熱休克步驟，該處理專用于滅活蛋白酶和其他潛在的干擾酶；大量的膜透析和過(guò)濾等進(jìn)一步處理步驟，可最大程度去除污染物，尤其是在敏感型體外診斷(IVD)測(cè)試中可能造成的背景干擾以及對(duì)敏感型細(xì)胞和細(xì)菌培養(yǎng)體系的抑制作用。

特性 / 優(yōu)勢(shì)

? 高純度，低干擾，低背景

? 幾乎沒(méi)有可檢測(cè)到的蛋白酶活性（確保檢測(cè)可信性）

? 優(yōu)良的溶解度/濾過(guò)率，方便使用

? 使用新西蘭初級(jí)產(chǎn)業(yè)部(MPI)認(rèn)證的牛血漿進(jìn)行生產(chǎn)

? 經(jīng)過(guò)朊病毒（傳染性海綿狀腦病(TSE)）去除驗(yàn)證

除卻用于ELISA實(shí)驗(yàn)的封閉，我們的BSA還能夠應(yīng)用于：

? 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋劑

? 蛋白質(zhì)，結(jié)合物或酶穩(wěn)定劑

? 雜交

? 特定細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用

除了為ELISA分析開發(fā)商和制造商提供化學(xué)和生物原料之外，在我們的ISO 13485和FDA認(rèn)證工廠內(nèi)，我們還廣泛代工生產(chǎn)IVD產(chǎn)品，包括ELISA和其他免疫分析。

無(wú)論您是將新產(chǎn)品推向市場(chǎng)還是希望將現(xiàn)有產(chǎn)品外包出去，您都可以與一個(gè)擁有超過(guò)351年生命科學(xué)制造經(jīng)驗(yàn)的原材料和成品生產(chǎn)合作伙伴實(shí)現(xiàn)無(wú)縫垂直整合。